基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
基因工程技术在微生物发酵生产中的应用
基因工程技术在微生物发酵生产中的应用随着生物技术的发展，基因工程技术成为了微生物发酵生产的重要手段。
利用基因工程技术可直接改变微生物的基因组，调控代谢途径，提高产物合成效率，改善发酵过程。
本文将探讨基因工程技术在微生物发酵生产中的应用现状。
1. 基因工程技术在微生物发酵生产中的应用简介微生物发酵生产技术是利用微生物代谢合成产物的过程。
在微生物发酵生产过程中，微生物代谢途径的调控及代谢产物的转化是关键。
基因工程技术在此领域的应用主要包括以下几个方面：（1）构建高效表达系统。
表达系统包括转录及翻译过程，构建高效表达系统是增强产物合成的重要手段。
常见的高效表达系统包括菌体内和菌体外表达系统。
（2）扩大代谢通路和合成代谢产物。
发酵生产产物的制备需要扩大代谢通路和增加原料供应，而基因工程技术可增加代谢途径中限速步骤的酶活性，提高产物合成效率。
（3）研究代谢途径调控机理。
代谢途径的调控可影响产物合成及发酵过程的效率，基因工程技术可研究代谢途径中的调控机理，并通过调控基因表达改善发酵过程。
2. 基因工程技术在微生物发酵生产中的应用案例基因工程技术已成功应用于微生物发酵生产中的多个领域。
以下是其中的几个应用案例：（1）蛋白质表达和摄取菌体内表达系统和菌体外表达系统是蛋白质表达和摄取的主要手段。
利用基因工程技术可引入大量表达载体，构建高效表达系统，提高蛋白质产量。
其中，重组酶是微生物发酵生产中的重要产物之一，以大肠杆菌为代表的微生物可合成多种重要酶。
（2）化学药品生产化学药品是微生物发酵生产的重要应用领域之一。
利用基因工程技术可调控代谢途径，增加代谢通路，提高产物合成效率。
例如，经基因工程改造的生产半胱氨酸的菌株可产生较高产量的半胱氨酸。
（3）生物农药制备生物农药是一种重要的环保型农药，以细菌农药为代表的生物农药已成为微生物发酵生产的热点领域之一。
利用基因工程技术，可提高生物农药的稳定性、毒力、毒谱及抗性。
例如，通过基因工程调控细菌发酵过程中的代谢途径，提高拟杆菌素等生物农药的产量和毒力。
(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)
第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。
2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。
3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。
5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。
2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。
3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。
简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。
基因工程菌发酵及相关技术交流
基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。
比如规模小，控制更精确，产物易失活等。
工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。
经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。
这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。
2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。
3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。
4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。
高密度发酵概述
5、培养温度
• 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢 的重要因素。较高的温度有利于细菌的高 密度发酵, 低温培养能提高重组产物的表达 量。一般大肠杆菌的最适生长温度是37 ℃, 而质粒稳定温度和目标蛋白的诱导温度大 多为30℃。
• 对于采用温度调控基因表达或质粒复制的 重组菌, 发酵过程一般分为生长和表达两个 阶段, 在不同培养阶段采用不同的培养温度
3、溶氧浓度
• 溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很 大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代 谢。
• 在高密度发酵过程中提高溶氧量的方法主要有： 增大搅拌转速；增加空气流量以增加溶氧量； 通 入纯氧来提高氧的传递水平；培养基中添加H2O2， 利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生O2； 提高氧的 分压。
二、实现高密度发酵方法
• 主要有：(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白 积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积 累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组 基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和 生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6) 后处理过程的优化。
一、影响因素
• 1、培养基的选择 培养基分为天然、组合和半组合培养基3
种。高密度发酵要获得高生物量和高浓度 表达产物, 一般使用的培养基为半组合培养 基。培养基各组分的浓度和比例要恰当, 过 量的营养物质反而会抑制菌体的生长, 特别 是碳源和氮源的比例。
2、接种量
• 接种量的大小直接影响发酵周期。接种 量小( 0.5 %～4 %) 时, 比生长速率大, 对数 生长期持续时间长; 接种量大( >8 %) 时, 细 菌较快地达到了稳定期, 持续生长时间短, 自溶也较快, 所以接种量一般选择在4 %以 下。
• 诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的 一个重要因素。一般控制在菌体的对数生 长期或对数中后期 。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵
第２ １卷 第 ３期
２ ００ ２பைடு நூலகம் ９ 月
大 连 轻 工 业 学 院 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＤａｉ ｎ Ｉ ｓｉｕ ｅｏ ｇ ｔＩ ｄ ｓｒ ｏ ｒ ａ ｌ ｎ ｔ ｔ ｆＬｉｈ ｎ ｕ ｔｙ ｏ ａ ｔ
Ｖ０ ． １ １２ ．Ｎｏ ３ ．
中图 分 类号 ： ７６ Ｑ ８
文献标 识 码 ： Ａ
Ｈｉ ｈ ｄ ｎ ｉｙ ｆ ｒ ｅ ｔ ｔｏ ｆｒ ｃ ｍ ｂｉ ｎｔｐｒ ｄ ｃ ｎ ｇ ｅ ｓｔ ｅ ｍ ｎ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｏ ｎａ ｏ ｕ ｉ ｇ ｐ ｔ ｓ ｃ ａ ｐ ｓ ｏ ｉ ｈｙ ａ ｅ Ｐｉ ｈｉ ａ ｔ ｒ ｓ
ｖ ｇ ｕ ｃ ｉｖ ｄ ４． ｉ ｏ ｒ ａ ｈ ｅ ｅ １× １ Ｕ ／ ０ ｍＬ．
植 酸 酶 能将 植 酸 降解成 肌 醇 或磷 酸肌 醇 和 磷 酸 ， 一种 优 良的食 品 和饲 料 添加 剂 ， 消除 单 胃 是 可 动物 因 不 能分 解 植 酸 而 引起 的 抗 营养 作 用 ， 高 提 机体 对 蛋 白质 及 多种 微 量 元 素 的 利 用 率 ， 有 良 具 好 的饲 喂效 果 ， 同时 ， 低 了磷 对环 境 的污 染 。 国 降 外对 植 酸酶 的研究 已有 ３ ０多 年 的历 史 ｕ Ｊ但 由 ，
艺稳 定 ， 酵周 期 可缩 短 一 半 以上 ， 菌体 产 量和 发 而 产物 表 达量 是 非 高密度 发酵 的 ｌ ～５ ０ ０倍 ， 白活 蛋 性 提高 ２ ～３倍 ， 可见 高 密度 发 酵具 有 无法 比拟 的
优点 ［ Ｊ 加 。本 文 作 者 利 用 Ｖｉ ｉ ｒ ｓ白控 发 酵 罐 ， 本 ｔ 对 实 验室 构建 的 一株 巴斯 德 毕 赤酵 母 的 植酸 酶工 程 菌 Ｇ １５ ｐ ｙ ｓ １ ／ ｈ Ａ １ 行 补 料 分 批 （ ｅｄＢ ｔ ） Ｉ进 Ｆ ｅ ａｃ 培 ｈ 养 ， 得 了较 高的 菌体 密度 ， 高 了该 系统 的表 达 获 提
基因工程菌发酵
基因工程药物制造实例
干扰素（interferon，IFN）是人体细 胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛 的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是 人体防御系统的重要组成部分。根据 分子结构和抗原性的差异分为α、β、 γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为 α1b α2a α2b等亚型。
1、基因工程菌的组建
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
2、质粒不稳定产生的原因 • 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； • 这两种菌比数率差异的大小。
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
平板培养基
10-12h
统计生长菌落数
重复三次,计算比值
(稳定性stability)
4、影响质粒稳定的因素
• 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对
其稳定性的影响； • 宿主对质粒稳定的影响； • 质粒拷贝数；
• 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响。
5、使质粒稳定的措施
组建合适载体 选择适当宿主 施加选择压力
大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶
大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶余玉奎;桂馨;李平;李敏【摘要】为提高大肠杆菌基因工程菌E.coli-pET21a高密度培养生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶产量,采用摇瓶培养的方法,通过考察培养液菌体量和酶产量,筛选适用于E.coli-pET21a液体深层发酵的培养基.50 L发酵罐采用适用于工业化大生产的搅拌、供氧、pH控制和过程补料方式,进行液体深层发酵放大培养,大幅度提高酶产量.通过优化发酵过程控制pH和诱导温度,发酵液酶活提高至88 U/mL,达到摇瓶培养的10.1倍.研究结果对大肠杆菌基因工程菌高密度培养,高效表达生物酶有重要的参考价值.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2018(048)002【总页数】6页(P29-34)【关键词】L-抗坏血酸-2-葡糖苷;维生素C;大肠杆菌;液体深层发酵;诱导剂【作者】余玉奎;桂馨;李平;李敏【作者单位】同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092【正文语种】中文维生素C(英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸)作为酸性药剂、还原剂、抗氧化剂、漂白剂以及化学反应物、食品和饮料中的稳定剂[1]，广泛应用于化妆、保健、医药、食品行业。
在医疗卫生方面，维生素C参与许多新陈代谢过程，具有提高人体免疫力、抗衰老、预防心血管、增加对感冒抵抗力、促进胶原蛋白的合成[2]、抑制癌细胞增殖[3],防治坏血病和传染病、促进创伤愈合等作用，是辅助治疗的保健药品[4]。
在化妆品中，维生素C可作为还原剂、紫外线吸收剂和黑色素形成抑制剂来使用[2]。
具有美白皮肤、预防色斑、抗氧化功效。
由于人体内缺乏古洛糖酸内酯氧化酶，不能自身合成维生素C，必须靠体外摄取[5]。
因此，维生素C被列为人体的必需营养元素，在保护人类健康和生长过程中起到不可替代的重要作用[1]。
生化工程-基因工程菌培养
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
IGF—I工程菌的高密度发酵与工艺优化
第３ ９
Ｉ — 工程茵的高密度发酵与工艺优化 ＧＦ Ｉ
陈蔚 青 陈 虹 汤铭 玉
（ 浙江树 人大 学生物 与环境 工程 学 院 浙 江杭州 ３ ０ １ ） １０ ５
摘
要： 为研 究表 达重 组 Ｉ Ｆ Ｉ Ｇ —（ 人胰 岛素样 生 长 因子一 ）－ 菌的优 化发 酵工 艺条件 ， ＩＹ程 ． 考察 了 ３种
不 同培养 基 以及 诱 导 时机 、 导剂量 和诱 导 时间对 蛋 白表 达 的影 响 ， ５ 自控 发 酵罐 进 行分批 补 料 培 诱 用 Ｌ
养 实验 ， 定 高密度发 酵工 艺条件 。结 果表 明 ， ２ ＹＴ ０ ％葡萄糖 为发 酵培养基 ， ０８ ｍｏ ＬＰ Ｇ 确 以 ｘ ＋． ５ 经 ．ｍ ｌ ＩＴ ／
Ｌ ２ Ｙ ＋ ．％葡 萄糖 、 Ｂ、 ｘ Ｔ ０ ５ Ｍ９等 培养 基 配 方参
缩小反 应器 的体积 。细胞 高 密度培 养可通 过补 料
分批 培养 法 实现 ， 方 法 既可 满 足菌 体生 长 与产 该 物积 累所 需 营养 ， 能 使各 种 培养 基 成分 低 于 抑 又 制浓 度 ， 尤其 是 可控 制 葡 萄糖 浓度 从 而 降低 代谢 抑制 物质 乙酸 的积 累 。大 肠杆 菌 （ ． ｌ 表达 系 Ｅｃ ｉ ｏ） 统是 基 因工 程菌 产 业化 的理想 系统 ， 具有 培养 方 便、 发酵 周期 短 、 本低 廉 等优 点 ， 重组 蛋 白在 成 但 大肠杆 菌表 达系 统 中能 否获 得高产 受诸 多因 素的
诱导 ５ ， ｈ 通过控 制溶 解氧 以及 ｐ 反馈 补料 方 式 ， 酵液 最终 菌体 密度 达到 ＯＤ １ （ Ｈ 发 ２ ． 菌体 ５ ． ／ ） 目 ７ ０１ Ｌ ， ｇ 的蛋 白表 达量约 占茵体 总蛋 白的 ３ ％。 立 了该 工程 菌优化 的 高密度发 酵工 艺 ， Ｉ — 的 下游纯化 和 ０ 建 为 ＧＦ Ｉ 工 业化生 产奠定 了基础 。 关键词 ： — 工程 菌 高密度发 酵 Ｉ ＧＦ Ｉ
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生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
创建人：时间：2013-04-17 【点击数：482】
实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
1．实验目的
（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理
重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。
此外，还需要考虑通风速度和搅
拌速度的增加，对泡沫和发酵液粘稠度的影响。
另外，工程菌的生长和繁殖也会使温度和PH值发生变化，也要及时进行调整在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量。
如果使用全自动发酵罐系统，发酵参数由计算机程序控制，则会大大完善高密度发酵工艺，因为程序化控制会使发酵参数自动达到最佳状态，而且参数的改变比手动要温和、平稳，这些都对工程菌的生长繁殖极为有利。
以上几个方面是建立工程菌发酵工艺的关键，对基因工程中的大多数工程菌来说，只要综合考虑，严格控制，都会建立起成熟稳定的高密度发酵工艺。
3．器材及试剂
（1）仪器
发酵罐、冷冻高速离心机，可见光分光光度计，恒温培养箱。
（2）试剂
①菌种和质粒宿主菌为BL21，表达质粒pET24a SA-IL-2和pET24aSA-GM-CSF由本研究所构建和常规保存。
②LB培养基（）
蛋白胨10g/L
酵母粉5g/L
NaCl 10g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
③2Y 培养基（）
蛋白胨16g/L
酵母提取物10g/L
氯化钠4g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
④半合成培养基（）
(NH4) 2SO4 L
NH4Cl 0. 3g/L
蛋白胨4g/L
酵母粉L
甘油10g/L
磷酸盐适量( KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4·12H2O=2∶4∶7)
微量元素MgSO4·7H2O L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑤补料基质（）
酵母粉5g/L
蛋白胨10g/L
MgSO4·7H2O L
甘油170g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑥Bradford蛋白浓度测定试剂盒
4．实验步骤
（1）发酵用菌种的筛选
取一管冷冻保存的甘油菌，用接种环接种于LB平板上，37℃培养过夜，随即挑选单克隆菌种于含有5mL LB培养液的试管中，30℃培养至A600nm为～时，IPTG诱导表达，离心收集菌体，进行SDS-PAGE以检测表达情况。
将表达量最高的克隆作为发酵用种子,分装冷冻保存，每批发酵取出一管,以保证菌种的稳定性。
（2）工程菌的培养
①种子的活化：取冷冻保存的工程菌株划板，37℃培养约16h，挑单克隆接种于含3ml LB培养基的试管中，37℃、200r/min培养10h左右，然后按试管培养基量的2%转种1次，在相同条件下培养4h即成为活化种子。
②工程菌三角摇瓶培养：取活化的种子，以2%接种量接种于含200ml 2YT培养基的500ml 摇瓶中，37℃、250r/min旋摇培养，当OD600值为1～2时可以作为5L发酵罐的菌种。
③5L高密度发酵培养：发酵罐中的起始工作体积为，在罐中接入200ml三角摇瓶培养的种子(接种量为4%)。
装料前校正pH和溶氧电极，发酵温度37℃，起始转速250rpm。
发酵过程的几个关键参数为：
A.溶氧量及转速：空气流速设定为每分钟1个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧量参数相关联，每30s提高或降低10r/min，溶解氧量控制在35%左右，最大转速达800r/min时通入纯氧；
值：自动流加30%的氨水，使pH值保持在左右；
C.补料的流加：根据实际经验，用甘油代替葡萄糖作为碳源。
补料的流加分两个阶段进行在5h的分批培养后，5～9h补加含5g甘油的补料；9～13h加入含100g甘油的补料。
以上数据由微机自动收集和记录。
整个发酵过程中,通过改变pH值、活化和诱导时间、溶解氧浓度和补料的流加，观察工程菌的生长和目的蛋白的表达。
（3）菌体浓度、目的蛋白表达量、菌体总蛋白的测定
①菌体浓度的分光光度测定波长为600nm；
②使用灰度扫描仪测定电泳条带中目的蛋白含量
③Bradford法测定菌体总蛋白
要点提示：
（1）发酵前应探索诱导外源基因高表达的最适条件，以使重组大肠杆菌既能高密度生长又能高效率表达外源目的蛋白。
要实现外源基因的高表达而又不过多地影响宿主菌的生存，就必须优化诱导时期、诱导培养时间、诱导剂浓度等参数。
（2）发酵的全过程中不加补料，则由于碳源和氮源的供给不足，而收菌量和表达量均很低；所以，应该根据基因重组菌的需求，将限制性底物(通常为碳源)不断流加到反应器中，可避免高浓度底物的抑制作用。
限制性底物的流加速率决定了细胞的比生长速率，从而影响重组菌的稳定性及外源基因的表达。
维持补料分批发酵中重组菌恒定的比生长速率，应采用指数流加的方式，也可采用阶梯式提高流加速率的方法。
（3）高密度发酵中为了减少补料的稀释作用，通常采用高浓度补料液。
这些浓液加入发酵液后，须立即混匀，否则细胞与局部的高浓度补料接触会造成代谢的失控。