基因工程菌的发酵控制
提高发酵产酶量的措施
提高发酵产酶量的措施一、优化培养条件1.1温度：在一定的温度范围内，大部分酶的活性随着温度的升高而增强。
因此，可以通过调整培养温度来提高发酵产酶量。
1.2 pH值：酶的活性受pH值影响较大，只有在适宜的pH值条件下，酶的活性才能得到充分发挥。
因此，可以通过调节培养液的pH值来提高发酵产酶量。
1.3溶氧浓度：对于好氧菌，发酵过程中的溶氧浓度对产酶量有显著影响。
可以通过调整搅拌速度和通气量来控制溶氧浓度，从而提高发酵产酶量。
二、基因工程2.1构建高产酶的基因工程菌：通过基因工程技术将目的基因导入到菌种中，构建高产酶的基因工程菌，从而提高发酵产酶量。
2.2基因表达调控：通过基因表达调控手段，如诱导表达、补料表达等，来提高目的基因的表达水平，从而增加发酵产酶量。
三、添加诱导物添加适当的诱导物可以促进酶的合成，从而提高发酵产酶量。
诱导物可以是天然的，也可以是人工合成的。
选择合适的诱导物并根据实验条件优化其浓度是提高发酵产酶量的有效手段。
四、细胞固定化通过固定化技术将菌体固定在载体上，可以提高菌体的生长速度和存活率，同时延长菌体的寿命并提高产酶量。
选择合适的固定化载体和工艺参数是实现这一目标的关键。
五、补糖与补料5.1补糖：通过适时补充葡萄糖等营养物质，可以促进菌体的生长和代谢，从而提高发酵产酶量。
同时，控制补糖速率和浓度可以有效避免对菌体生长和产酶的抑制作用。
5.2补料：适当的补料可以延长发酵周期，提高产物浓度。
选择合适的补料种类和添加时机是关键。
六、降低产物抑制6.1控制产物浓度：产物浓度过高可能会对菌体的生长和产酶产生抑制作用。
因此，在发酵过程中应控制产物浓度在适宜范围内，避免其对发酵过程的影响。
6.2添加抗抑物：某些物质如丙酮酸、硫酸铵等可以减轻或消除产物对菌体生长和产酶的抑制作用。
在发酵过程中适时添加这些物质可以提高发酵产酶量。
七、提高搅拌速率提高搅拌速率可以增加溶氧浓度，促进菌体生长和代谢。
但同时也会增加能源消耗和剪切力对菌体的损伤。
基因工程菌发酵培养的流程
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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。
工程菌的知识
工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。
研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。
这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。
关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。
要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。
这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。
对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。
E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。
基因工程菌发酵及相关技术交流
基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。
比如规模小，控制更精确，产物易失活等。
工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。
经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。
这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。
2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。
3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。
4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
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发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
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基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
发酵过程优化与控制(原理部分)
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大型发酵罐 搅拌装置
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现代发酵工程的主要研究内容
1.发酵过程的优化控制技术 2.生化过程的模型化 3.高密度培养技术 4.代谢工程和代谢网络控制 5.新型生化反应器的研究和开发 6.新型发酵和产品分离技术
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第一章
绪论
一. 发酵过程优化在生化工程中的地位 二. 发酵过程优化的目标和研究内容 三. 发酵过程优化的研究进展 四. 流加发酵过程的优化控制
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一. 发酵过程优化在生化工程中的地位
现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、 药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地 生产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊 化学品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环 境等重大问题的过程中必将发挥积极的作用 如何才能更好地发挥现代生物技术的作用？ 以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是 一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必 须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度(便于下 游处理)、较高的底物转化率(降低原料成本)和较高 的生产强度(缩短发酵周期) 20
养或半连续发酵，是指在分批发酵过程
中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵
方法
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流加发酵的研究进展
在20世纪70年代以前流加发酵的理论研究 几乎是个空白，流加过程控制仅仅以经验为 主，流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加
1973年日本学者Yoshida等人首次提出了 “Fed-Batch Fermentation”这个术语，并从理 论上建立了第一个数学模型，流加发酵的研究 才开始进入理论研究阶段
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基于碳氢化合物的经济转变为基于 碳水化合物的经济
将工业革命世纪转变到生物技术世纪 只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再
基因工程生产蛋白
基因⼯程⽣产蛋⽩基因⼯程法⽣产多肽和蛋⽩类药物基因⼯程法⽣产多肽和蛋⽩类药物，系指将合成多肽或蛋⽩的基因分离纯化后，结合上合适的表达载体转⼊它种⽣物并稳定遗传和表达的过程。
基因⼯程法⽣产多肽和蛋⽩类药物包括基因⼯程菌(细胞)构建、发酵(或细胞培养)、分离纯化、检验及制剂等环节，其中基因⼯程菌(细胞)构建⾄为关键。
基因⼯程菌(细胞)常⽤的宿主菌(细胞)包括微⽣物和真核⽣物细胞，最常⽤的有⼤肠杆菌、酵母菌和中国仓⿏卵巢细胞，其中尤以⼤肠杆菌和酵母菌最为普遍，是本章介绍的重点。
⼀、⽣产⽤微⽣物的来源及发酵特性⽣产⽤微⽣物主要来源于两个⽅⾯，⼀是从⾃然界分离，⼆是⼈⼯改良。
从⾃然界分离到的微⽣物由于受⾃⾝代谢调节的控制，蛋⽩类药物的合成量⼗分低。
另外，⾃然界中的微⽣物合成的蛋⽩质药物各类也⼗分有限。
为了提⾼蛋⽩类药物的产量，丰富其种类，对⾃然界分离的微⽣物进⾏改良成为必然。
改良⽅法主要有⼈⼯诱变法和基因⼯程法，其中尤以基因⼯程⽅法⽤得最为普遍。
基因⼯程⽅法改良微⽣物，就是通过把某⼀特定的外源基因，通过⼀定的载体，放⼊宿主细胞内，使之随宿主细胞的⽣长和繁殖⼀起复制和表达。
外源基因的表达产物属于异已物质，并可能对宿主细胞有毒性。
⼤量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的⽣长平衡，如⼤量的氨基酸被⽤于合成与宿主细胞⽆关的蛋⽩质，从⽽影响其他代谢过程。
有的表达产物本⾝对细胞有害，表达产物的⼤量积累可能导致细胞⽣长缓慢甚⾄死亡。
由于基因⼯程产物在细胞内过量合成，必然会影响宿主的⽣长和代谢，⽽细胞⽣长受限，⼜反过来抑制了外源基因产物的合成。
所以必须合理调节这种消长关系，使宿主细胞的代谢负荷不⾄于过重，⼜能⾼效表达外源基因。
为了减轻宿主细胞的代谢负荷，提⾼外源基因的表达⽔平，可以采取当宿主细胞⼤量⽣长时，抑制外源基因表达的措施。
即将细胞的⽣长和外源基因的表达分成两个阶段，使表达产物不会影响细胞的正常⽣长，当宿主细胞的⽣物量达到饱和时，再进⾏基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷。
简述基因工程菌的培养方式
简述基因工程菌的培养方式基因工程菌是指通过基因工程技术将目标基因导入到细菌中，使其表达目标蛋白或产生目标物质的菌株。
基因工程菌的培养是进行基因工程研究和应用的重要环节之一。
下面将从菌株的选择、培养基的配制、培养条件的控制等方面简述基因工程菌的培养方式。
一、菌株的选择菌株的选择是基因工程菌培养的第一步。
常用的基因工程菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等。
选择菌株时需要考虑其生长速度、基因导入效率、表达目标蛋白的能力等因素。
一般情况下，大肠杆菌是最常用的基因工程菌株，因为其生长速度快、易于培养和转化。
二、培养基的配制培养基是基因工程菌培养的基础，其组成要能满足菌株生长和表达目标蛋白的需要。
一般的培养基包括基础培养基和选择性培养基。
基础培养基是提供菌株生长所需的营养物质，如碳源、氮源、矿物质等。
选择性培养基则是通过添加特定的抗生素或抗性基因使得只有带有目标基因的菌株能够生长和繁殖。
培养基的配制需要根据具体实验的需要和菌株的特性进行调整。
三、培养条件的控制培养条件的控制对于基因工程菌的培养至关重要。
其中包括温度、pH值、气体环境、培养时间等因素的控制。
一般情况下，基因工程菌株的适宜生长温度为37℃，pH值为6.5-7.5。
气体环境方面，大肠杆菌一般需要在含氧的条件下培养，而酵母菌则需要在缺氧条件下培养。
此外，培养时间也需要根据菌株的生长速度和目标蛋白的表达时间进行调整。
四、培养方式的选择基因工程菌的培养方式主要包括液体培养和固体培养两种。
液体培养适用于大规模培养和蛋白表达，可以通过摇瓶培养或发酵罐培养进行。
固体培养适用于筛选和分离菌株，常用的固体培养基有琼脂和琼脂糖。
同时，还可以根据实验需要选择特定的培养方式，如表达载体的选择、诱导剂的添加等。
五、培养监测和收获在培养过程中，需要定期监测菌株的生长情况和目标蛋白的表达情况。
常用的监测手段包括测定菌液的光密度(OD值)、蛋白含量的测定、酶活性的检测等。
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基因工程菌的发酵控制
近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制
由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制
在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
使质粒稳定的主要措施：首先是组建合适载体和选择适当宿主，关于这两项措施应在构建携带质粒工程菌时即应加以考虑。
在发酵过程中可以：
（1 ）、施加选择压力
利用某些生长条件，只让那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。
在重组菌发酵时，常采取这种方法来消除重组质粒的不稳定性，以提高菌体纯度和发酵生产率。
抗生素添加法因重组菌中常含有抗药性基因，因此可添加相应的抗生素来限制非重组菌的生长。
但由于抗生素的存在往往在一定程度上会影响目的产物的合成，增加产物提取的难度，而且对一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素所造成的选择压力只能维持一定的时间。
如带Ap r 基因的克隆株在Ap 浓度为50 、200 、1000μg/mL 的培养基中培养16 小时后，含有重组质粒的细胞数占总细胞数的比例分别为40% 、60% 和100% ，再加上发酵过程中受成本的限制，所以大规模生产时此法并不可取。
抗生素依赖型变异法通过诱变使受体细胞成为某抗生素的依赖型突变株，即只有在该抗生素存在时受体细胞才能生长，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖基因，将重组质粒导入后，克隆菌能在不含抗生素的培养基中生长。
此方法可节约大量抗生素，但克隆菌易发生回复突变。
营养缺陷型法受体细胞是营养缺陷型的，不能在选择性培养基上生长，而质粒中含有此基因，克隆后克隆株能在选择性培养基上生长。
如构建带色氨酸操纵子的重组质粒pBR322-trp ，在质粒上插入serB 基因，而受体细胞是serB 缺陷型的，因此只有重组菌才能在不含Ser 的培养基上生长。
（2 ）、控制基因过量表达
由于外源基因表达水平越高，重组菌往往越不稳定。
因此一般采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传，到后期，通过提高质粒的拷贝数或转录翻译效率，使外源基因高效表达。
可诱导启动子在构建表达质粒时，可以使用可诱导的操纵子，如lac 、trp 等。
在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）至一定时期，在此期间质粒稳定地遗传，然后通过去阻遏（诱导），使质粒高效表达，例如利用3-β- 吲哚乙酸可以使trp 启动子去阻遏。
温度敏感型质粒某些质粒在温度较低时，质粒拷贝数少，温度升高后，大量扩增，这种质粒称“脱缰质粒”（runaway plasmid ），如pKN402 和pKN410 在30℃时拷贝数为20~50 个/ 大肠杆菌细胞，而35℃时大量复制。
若将β- 内酰胺酶基因接在此质粒中，经热诱导后，β- 内酰胺酶活力可增强400 倍。
（3 ）、控制培养条件
培养基组成不同的培养基能影响微生物的代谢活动，也能影响质粒的稳定性。
有人认为质粒在丰富培养基中比在最低限量培养基中更加不稳定。
培养温度含有重组质粒的克隆菌的比生长速率往往比受体菌要小，同样质粒导入受体菌后会使受体菌的生长温度改变。
通常而言，低温有利于重组质粒稳定地遗传。
菌体比生长速率调整重组菌及受体菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但要做到这一点非常困难，因为大多数环境条件可同时提高或降低这两种菌
的比生长速率。
在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，来提高重组质粒的稳定性。
如在重组质粒中克隆入抗高浓度抑制的某个基因，这样在进行高浓度底物培养时，受体菌被抑制，比生长速率下降，而重组菌仍能正常生长。
综上所述，选定一个合适的受体菌十分重要。
基因工程操作中常用的受体菌是大肠杆菌，它最大的缺点是代谢产物很难分泌出胞外，让枯草芽孢杆菌把代谢产物分泌出来是可能的，但由于产芽孢，难于培养到高浓度，而不产芽孢的变易株往往很难培养，因此应该适当考虑用其他微生物作受体。
为了高效率地生产代谢产物，还应考虑每个细胞的质粒数、质粒的稳定性及转录和翻译的效率等。
质粒越多，产量越高，但增殖速度越慢，而且质粒越易脱落，脱落的速度越快；表达水平越高，重组质粒越不稳定。
因此在实际生产中可考虑用两阶段培养方式，第一阶段主要考虑增殖，第二阶段主要考虑目的基因的表达。
也可通过改变温度、用双罐连续培养等方式，或用添加或去除药剂的方法来提高基因产物的产量。
3 、工程菌外逸的控制
由构建的工程菌所携带的转入基因对于环境的长期安全性仍具有风险性，目前有关法规都明确规定工程菌不能扩散到自然环境中，因此应采取以下措施以防菌体外逸。
（1 ）、排气控制排出的气中含有大量气溶胶，在剧烈起泡的培养物中，培养液呈泡沫状，它们从排气口向外排出，重组菌也容易随之外漏。
控制办法：在通用通气型培养罐上安装排气鼓泡器（见图7-13 ），气体通过排气管到鼓泡瓶，再通过膜滤器，瓶中可加入杀菌剂（如2N NaOH ），或用电热器将排气加热至200℃，杀灭工程菌。