第9章动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程是农业和食品生产中利用生物技术来修改和优化
动物基因组以实现预期目标的一种技术。
它涉及研究和开发改良动物性状，提高动物产量，增强动物健康，改善食品品质和动物营养，以及建立更安全，更有效和更合理的动物繁殖和饲养方法等。
动物基因工程可以把有用的基因组合插入动物体内，以获得更好的性状和能力，从而提高生产效率。
它的应用可以从肉类，乳制品，蛋类，水果和蔬菜等多个方面来看，改善产品的质量和性能，增加其生产量和可持续性。
实施动物基因工程的主要技术有转基因技术和编辑技术。
转基因技术通过将有用的基因插入动物体内来修改它们的性状，通常是将来自其他生物体中的基因插入动物体内。
编辑技术则是在动物体内编辑现有基因，而不是添加新基因，以获得预期的性状。
动物基因工程也是值得讨论的话题，它有助于提高食品安全，增强抗性，延长保质期，改善质量，提高产量，简化品种，等等。
这些改变的从繁殖和遗传学角度都是永久的，即使留下的影响是未知的也可以预见。
当然，它也可能带来一些负面影响，例如引发环境污染或威胁多样性。
因此，必须在研究和使用动物基因工程技术时，严格遵守环境和健康安全法规，并进行足够的监管。
总之，动物基因工程在提高动物的性能和效率方面提供了一种新的途径，但实施此项技术要非常小心，以确保安全和优势的持续使用。
- 1 -。
《动物基因工程》课件
动物基因工程面临的挑战
技术难度
动物基因工程涉及到复杂 的生物学和遗传学知识， 技术难度较大。
伦理和法律问题
动物基因工程涉及到伦理 和法律问题，需要制定相 应的法规和伦理规范。
社会接受度
动物基因工程需要得到社 会的广泛接受和支持，需 要加强宣传和教育。
增强农业生产力
动物基因工程可以提 高农业生产效率，保 障粮食安全。
THANKS
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生态平衡维护
基因工程动物释放到环境中可能对生态平衡产生影响，引发伦理考 量。
基因歧视
基因工程动物可能引发对某些人群的基因歧视，需要关注平等和公正 的伦理原则。
国际动物基因工程法规
《关于转基因生物安全性的准则》
联合国粮食及农业组织与世界卫生组织共同制定的国际法规，旨在确保转基因生物的安全使用 和释放。
常见的基因修饰动物包括基因敲入动物、基因 敲除与敲入相结合的动物、条件性基因敲除动 物等。
基因修饰动物制备过程中需要关注基因修饰位 点的选择、修饰效率、表型变化等多个因素， 以确保基因修饰动物的制备成功和实验效果。
04
动物基因工程伦理与法规
动物基因工程伦理问题
动物权益保护
基因工程对动物福利的影响，如疼痛、疾病和死亡在实验过程中所 涉及的伦理问题。
福利。
动物基因表达调控
1 2
基因表达调控机制
包括转录水平调控、转录后水平调控和翻译水平 调控等。
调控方式
包括DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA调节等 。
3
调控的意义
通过调控基因表达，可以影响动物的生长发育、 生理功能和行为表现等。
09转基因动物与生物反应器-HXY78页PPT
转基因动物技术路线
外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物
转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系
哺乳动物生殖生理
哺乳动物受精和妊娠，整乳动物的制备方法
显微注射法 逆转录病毒载体感染 胚胎干细胞介导法 精子载体介导法 YAC介导的基因转移
1 显微注射法
雄性原核
显
受精卵
微
注
射
显微注射
法
操
作
胚胎移植
流
程
后定检测
显微注射法的优点
a、转移率较高、整合效率达30%； b、外源基因长度可达50Kb； c、方法简单，导入过程直观；
缺点
a、设备昂贵、操作复杂； b、随机整合、首尾相连的多拷贝； c、常造成插入位点附近宿主DNA大片
段缺失、重组等突变，出现动物严重 生理缺陷； d、外源基因能否稳定整合要到子一代 中筛选得到。
1987年美国科学家戈登（Gordon）等 人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋 白──tPA（组织型纤溶酶原激活物）， 展示了用动物乳腺生产高附加值产品的 可能性。利用动物乳腺生产高价值产品 的方式称为乳腺生物反应器。
微生物反应器 植物反应器 动物反应器
(一) 优点 1可以利用发酵工程 技术大规模生产。 2 胞外活性物质制备 容易。 （二）不足 1哺乳动物或人类的 基因往往不能表达。 有些表达了，却没有 活性，需要进一步修 饰。 2真核生物蛋白质翻 译后加工的精确性有 限。 3需要大型发酵设备 和车间。 4细菌发酵常形成不 溶聚合物，使下游加 工成本增加。
疾病模型
基因转移方法
转导的基因
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
第一章 基因工程概述
或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基
本元件。
基因工程的基本概念
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，
包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的
是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技
术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模
酶工程
基因工程的基本概念
D 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程
第四代基因工程 基因组或染色体的转移
基因组工程
第二节 基因工程的诞生和发展
一、基因
泛基因阶段
孟德尔遗传因子阶段
（如胰岛素）、干扰素、乙肝疫苗等 研制新型疫苗（HIV、霍乱、单纯疱疹病毒等）
生产具有药用价值的生物制剂，如水蛭素等
3. 基因诊断
– 遗传性疾病的分子诊断
– 癌症的分子诊断 – DNA指纹
4. 基因治疗
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治疗目的。
3．断裂基因
1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为 断裂基因。
4．假基因
不能合成出功能蛋白质的失活基因 。
5．重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。
现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列， 是遗传物质的最小功能单位。
二、 基因工程的诞生
顺反子阶段
1957 年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌 体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结 构，提出了顺反子（cistron）概念。 顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定 1条多肽链。
动物病毒学课件第9章 单链DNA病毒
➢WUH-1株全长4.8kb
➢进化分析证实属于博卡病毒
NP1 NS1
VP1/2
PBoV-4F
犊牛的腹泻，给养牛业造成了巨大损失
猪博卡样病毒是不是博卡病毒？
由于以前的研究只是通过部分基因片段和进化系 统树分析推测并命名为猪博卡样病毒，没有从全 基因组水平上证实，因此猪博卡样病毒是否属于 博卡病毒还需要进一步验证。
猪博卡样病毒WH-1株的全基因组序列分析
➢根据报道的1.8kb 的序列从临 床上检测到阳性样品，采用简 并引物方法获得了WH-1株的 全基因组序列
✓75℃以上加热处理后，病毒的血凝效价几乎完全 消失，弱酸性到中性的介质适于血凝特性的保持。
3.培养
➢细胞：
✓猪源cell：原代猪肾、猪睾丸细胞 传代细胞系PK-15、IBRS-2
✓人的某些传代cell系：Hela、Hep-2
➢接种方式： ✓同步接种 ✓细胞长成单层前接种
➢病毒的增殖需要正处于有丝分裂期的细胞的某些机 能的辅助。
第九章 单链DNA(ssDNA)病毒
➢9.1 细小病毒科（Parvoviridae) ➢9.2 圆环病毒科（Circoviridae)
9.1 细小病毒科（Parvoviridae)
DNA replication ξ=10-10-10-9 RNA transcription ξ=10-5-10-4 ssDNA 细小病毒 ξ=8×10-4
犬细小病毒
肠炎、心肌炎、白细胞减少
水貂肠炎病毒 白细胞减少、肠炎
水貂阿留申病毒 慢性免疫复合物疾病、脑炎
鹅细小病毒
肝炎、肠炎、心肌炎
猫泛白细胞减少 大脑发育全、白细胞减少、肠炎
症病毒
牛细小病毒
犊牛腹泻
动物基因工程ppt课件
（2）腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）
腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性 单链DNA病毒，其复制需要有辅助病毒的共转 染。无共转染时，野生型AAV优先（70%） 整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在 直至被辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组 两端的ITR，以及非结构基因编码的蛋白 Rep78 和Rep68的存在。
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原病毒DNA 转染进包装 细胞中，包 装原病毒产 生将病毒 RNA包装成 感染性病毒 粒子的所有 蛋白质，但 却不能包装 自身的RNA
图 4逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因
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第三节 转基因动物制备
转基因动物的制备程序 转基因鉴定 表达水平的检测 转基因动物传代与检测
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一 转基因动物的制备程序
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以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例
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2. 病毒载体
作为基因转移的病毒载体须具备以下 基本条件： 携带外源基因并能够包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移与表达
对机体不致病
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（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： • 基因组的重排率低 • 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个 周期 • 安全性好，不会整合到人的染色体上， 不导致肿瘤的发生 • 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂 期要求不高 • 外源基因在载体上容易高效表达
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动物基因工程载体
质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
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1 .质粒型表达载体
表达载体的共同特点是都带有原核复制 区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能 够在大肠杆菌中扩增，同时也必须包括能在 真核细胞表达的相关组件。一般包括转录外 源DNA序列的启动元件、转录产物有效地加 上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核 细胞中的选择性标记，另外还增加了一些附 加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受 点，以保证外源基因的高效表达。
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
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•3. 整合位点的优化 •目的基因在细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的 基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中 的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染 色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的 基因。因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录 活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需 的一步，主要通过以下几种策略实现。
第9章动物基因工程
2020/11/27
第9章动物基因工程
•第一节 动物细胞基因工程
• 采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点： •①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接 加工成成熟的mRNA； •②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基 化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，加工 后的蛋白质免疫原性好，约为酵母型的16~20倍； •③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定 性和可重复性； •④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基 中，提纯工艺简单，成本低。
第9章动物基因工程
•（6）Vero细胞 • 该细胞是从正常的成年非洲绿猴肾分离获得的， 一株具有贴壁依赖性的成纤维细胞。可持续地进行细 胞培养，并可支持多种病毒的增殖并制成疫苗 。 •（7）鼠骨髓瘤细胞 • 骨髓瘤细胞是“专业”的分泌细胞，在培养上清中 可产生高达100mg/L的免疫球蛋白（Ig），而且容易转 染，容易生长，可在无血清培养基中高密度的悬浮培 养；能对蛋白质进行糖基化修饰；高效表达Ig基因的 调控成分明确，有利于表达载体的增强子和启动子的 合理设计。
第9章动物基因工程
• 2 宿主细胞 • 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞 几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着 一些不足， • 因此，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿 主细胞试用于真核细胞的表达系统中。 •（1）BHK-21细胞 • 该细胞最早从地鼠幼鼠的肾脏分离，现在广泛应用的 是采用单细胞分离技术经13次克隆的细胞。原始的细胞 株是成纤维样细胞，并且具有贴壁依赖性，但经无数次 传代后细胞可悬浮生长。
第9章动物基因工程
•二、动物细胞表达载体的构建 • 目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染 色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、 翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的 哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位 点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增 加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调 控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面 对此作一介绍。
第9章动物基因工程
•（2）CHO-K1细胞 • 该细胞是CHO细胞的一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr— ）的营养缺陷突变株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）压力下 使外源基因的基因拷贝数扩增，使外源蛋白质得到较高水 平表达。 •（3）C127细胞 • 该细胞来自RIII 小鼠乳腺肿瘤细胞，适用于带有牛 乳头瘤病毒（BPV）载体的转染。当用BPV-1病毒载体 转染后，细胞的生长形态可发生显著变化，因此转染 成功的细胞可通过特有的转化形态加以识别。
第9章动物基因工程
•一、动物细胞表达体系 • 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部 分组成。 •1 表达载体 • 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒 载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞 膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载 体有 ： •（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体 •（2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体 •（3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载 体 •（4）质粒载体
第9章动物基因工程
•（4）MDCK细胞 • 该细胞是从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得 ，是具有贴壁依赖性的上皮样细胞，已成功地在微载体 上增殖。该细胞能支持多种病毒的增殖，已被用来生产 兽用疫苗。 •（5）Namalwa细胞 • 该细胞是一株人的类淋巴母细胞,来自名为 “Namalwa”的Burkitt淋巴瘤患者，含有部分疱疹病毒 基因，但不产生疱疹病毒。该细胞已被批准用于大规 模生产α干扰素，可以用无血清培养基在悬浮状态下 高密度培养，可有效地表达外源基因。
第9章动物基因工程
•（8）COS细胞 • 该细胞是利用复制起点缺失的SV40转染非洲 绿猴肾细胞CV-1而获得，具有COS-1、-3、和-7三 个细胞系。由于COS细胞来源广，易培养，易转染； 能组成性表达SV40大T抗原，能使大多数哺乳动物 细胞携带有复制子的质粒以附加体形式高拷贝扩增； 大量扩增的质粒及其高表达的mRNA和蛋白质，容 易回收和分析，因此被广泛地用于瞬时表达系统。
第9章动物基因工程
•1. 转录水平 • 在目的基因拷贝数一定，整合位点固定的情况下 ，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个 高效表达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其 相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对 转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强 启动子、强增强子是提高转合结构域特 异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激 活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启 始基因的转录和表达。因此，提高宿主细胞转录因子 的表达水平也能增强目的基因的表达。
第9章动物基因工程
• 2. 翻译水平 • 除了转录水平的调控外， 翻译水平的调控和翻译产 物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要 的影响。Ploy（A）的存在不但能影响mRNA稳定性， 而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA 翻译水平；内部核糖体进入位点（IRES）能使同一 mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达 ；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏 好的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大 幅度提高翻译效率。