巨噬细胞的原代培养
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。
可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。
2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。
细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。
3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。
4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。
5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。
6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。
这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法(超详细~)
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。
实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。
注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。
（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。
（3）固定小鼠，暴露腹腔。
（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。
（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。
（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。
（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。
（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。
（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。
（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
步骤一、实验材料准备1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。
2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。
碘酒绵球和酒精绵球。
3. 器械：一次性注射器、手术器械。
二、实验方法如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。
不采用刺激物，直接开始下面的步骤。
1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。
用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。
2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。
3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。
台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。
4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
三、结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
巨噬细胞培养
1.培养瓶 离心管 注射型滤器（正压过滤器） 2.手术器材：镊子 手术剪 止血钳 注射器 针头 3.包装用品 支架：饭盒 包装纸 硫酸纸 棉线 准备：
1. 清洗： 刷洗，煮沸后加洗剂 冲洗，振荡冲洗15-20次 酸泡，烤干后泡24h 浸泡，去离子水2次，每次24h，新玻璃器材5%HCL
（37℃，5％CO2）培养 2-3 小时。
（6）除去培养液，用 Hanks 液冲洗培养孔 2-3 次，去除未贴壁细胞，
纯化巨噬细胞，再用RPMI1640液冲洗1-2次，再加入RPMI1640（10％
无支原体胎牛血清）培养液备用。
（7）细胞的传代培养
（8）普通光镜下细胞计数，鉴定，检测活性
小鼠腹腔巨噬细胞的鉴定 用酸性磷酸酶法鉴定巨噬细胞。 （1）取出有细胞贴壁的盖玻片放于载玻片上，用 HANK’S液冲洗 2-3 次，放入冰箱（4℃），30分钟后取出，在细胞贴壁细胞上滴加 10％中 性甲醛溶液数滴，放入冰箱（4℃）固定30 分钟。 （2）自来水漂洗5 分钟，把水沥干。 （3）在固定好的细胞上滴加酸性磷酸作用液数滴，37℃处理 30 分钟。 （4）自来水漂洗3-5 次。 （5）在细胞上滴加1％硫化铵3-5 分钟。 （6）自来水冲洗3-5 次，甩干。 （7）在细胞上滴加吉姆萨染色液染色15 分钟。 （8）自来水冲洗3-5 次去除多余染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜 检。 玻璃器皿： 1.浸泡：洗涤剂中浸泡数小时，刷洗，5%HCL浸泡12h以上 2.刷洗：在洗剂中毛刷（软毛，轻用力，注意更换），充分冲洗，晾干 3.浸酸：6h以上，最好过夜 清洗液配方： 强 次 弱 重铬酸钾（g）:63 120 100 浓H2SO4(ml):1000 200 100 蒸馏水（ml）：200 1000 1000 4.冲洗：自来水（压力），瓶内盛满水，倒空10次以上，重蒸水浸洗2-3 次，烘干后包装 胶塞：水浸泡，2%NaOH煮沸10min,自来水冲洗晾干，1%稀HCL浸泡 30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用 塑料：水泡，自来水冲洗（不刷洗），2%NaOH过夜，自来水冲洗， 1%稀HCL浸泡30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用
巨噬细胞的分离、纯化与培养
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
bmdms培养方法
bmdms培养方法
BMDMS是指骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages）。
它们是一种重要的免疫细胞，常被用于研究免疫学、生物学和疾病模型等方面。
下面我将从多个角度介绍BMDMS的培养
方法。
1. 材料准备。
常用培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS）或去
血清培养基，还有抗生素如青霉素/链霉素。
2. 培养骨髓细胞。
首先需要从小鼠或大鼠的骨髓中分离细胞。
通常使用灭菌的
方式，将小鼠或大鼠的胫骨和腓骨取出，用培养基冲洗骨髓腔，将
细胞悬浮液通过滤网筛选，得到单个的骨髓细胞。
3. 培养和分化。
将分离得到的骨髓细胞接种在培养皿中，培养基中含有巨噬细胞分化因子如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。
细胞培养在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基，培养7-10天左右，即可得到成熟的BMDMS。
4. 细胞纯化。
有时为了得到更纯净的BMDMS，可以利用差速贴壁法（adherence method）或密度梯度离心分离等技术进行细胞纯化。
总之，BMDMS的培养方法是一个复杂而精细的过程，需要严格控制培养条件和培养基的配方，以确保得到高质量的巨噬细胞。
同时，培养过程中的细胞分化、纯化等步骤也需要根据具体实验的要求进行调整和优化。
希望以上信息能够对你有所帮助。
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，用于研究免疫和炎症反应的机制。
以下是一种常用的人巨噬细胞培养方法：
材料：
1. 人外周血单个核细胞（PBMC），来源可以是新鲜的外周血样本或者离心分离的PBMC。
2. 无血清RPMI 1640培养基，含有GlutaMAX、非必需氨基酸、钠硼砂缓冲液等。
3. 10% 热灭活胎牛血清（FBS）。
4. 非必需维生素溶液。
5. 100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液。
步骤：
1. 将PBMC离心沉淀，并用PBS洗涤2次，以去除血浆。
2. 将PBS去除，加入无血清RPMI 1640培养基，使细胞悬浮。
3. 细胞计数，并用无血清RPMI 1640培养基将细胞浓度调整至合适的浓度（一般为1x10^6细胞/ml）。
4. 在无血清RPMI 1640培养基中加入10% FBS，以提供细胞生长所需的营养物质。
5. 在培养基中加入1% 非必需维生素溶液，以提供额外的维生素补充。
6. 加入100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液，以防止细菌污染。
7. 将细胞悬浮液移入含有6孔或12孔培养板中的培养皿，并在37°C的培养箱中培养。
8. 培养细胞时，每隔2-3天更换一次培养基，以保持细胞的健康生长。
9. 在培养期间，可以根据需要添加不同的刺激剂（如细菌成分、细胞因子等）来激活细胞，并观察其对刺激的反应。
这是一种基本的人巨噬细胞培养方法，根据具体的实验需求和细胞类型的不同，培养条件可能会有所调整。
小鼠肺泡巨噬细胞的分离与培养
小鼠肺泡巨噬细胞的分离与培养巨噬细胞通常有两个不同的亚群：经典激活M1型，具有促炎作用。
可被LPS单独或与Th1细胞因子(如IFN-γ，GM-CSF)联合极化，并产生促炎细胞因子，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α；第二种是交替激活M2型巨噬细胞，具有抗炎和免疫调节作用，被Th2细胞因子IL-4和IL-13极化，产生IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子。
目前实验常用的细胞系有RAW264.7，THP-1以及原代BMDM细胞等，而肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages, AM)比较少用但研究很有必要。
AM是肺的常驻组织巨噬细胞，在出生前后定植于肺部，在成年生物体中无需单核细胞的贡献即可长期自我维持，对免疫调节和表面活性剂稳态至关重要。
由于AM定位于肺泡的空气空间，所以直接暴露于吸入的空气和病原体或其他雾化颗粒中。
我们可以通过支气管肺泡灌洗法(BAL)清洗肺部收集。
一、方法：通过支气管肺泡灌洗(BAL)获取肺泡巨噬细胞。
1. 为每只老鼠准备一个15mL的锥形管，管内装有3mL完整的培养基。
2.将BAL缓冲液(PBS+EDTA)在水浴中加热至37°C，在整个过程中要注意保持温度。
3.在不破坏颈静脉或气管的情况下，采用颈椎脱位法对小鼠实施安乐死，避免AM暴露于CO2或异氟醚中，影响AM的功能特性。
4. 使用解剖工具，切除皮肤、胸腔和肌肉，露出肺和气管，避免割伤或破裂血管。
5. 用一把细剪刀在喉头下方的气管上部做一个小切口，气管朝下的部分(远离实验者)应保持完整，不要切开整个气管。
6. 使用切口插入一根稍钝的18-G套管，将套管插入气管向肺方向深5mm，注意不要损伤肺组织。
7. 将1mL注射器吸取1mL温热BAL缓冲液连接到插入的套管上。
8. 注射缓冲液1mL，另一只手固定套管位置。
9. 拉动柱塞收集注射器中的BAL液。
回收率约为800 ~ 900 μL。
注意气压不宜过高，否则肺泡破裂，BAL液流失。
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1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。
我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。
2试验材料
昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供
公鸡1只
PRMI1640培养基
新生小牛血清
HEPES
D-Hanks液
青霉素
链霉素
3试验仪器
无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。
二氧化碳培养箱
生物显微镜
高速冷冻离心机
低温冰箱
4实验步骤
4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法:
将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。
鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。
使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。
培养液的无菌处理：
(1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。
(2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。
(3)将新生小牛血清200m1，在56℃水浴中灭活30分钟，按10%的浓度分别加入培养液中备用。
4．2巨噬细胞的获取
4.2.1 以颈椎脱臼法处死小鼠。
4.2.2 手提鼠尾将其全浸入75%乙醇中5min，倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至4℃PRMI1640培养液5ml（注意针尖勿伤及内脏），仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3min，静置5～7min。
4.2.3 置小鼠于解剖台，用针头固定四肢，在腹股沟区作一横切口，撕裂皮肤以完全暴露出腹膜壁，但勿伤及腹膜壁。
用75%酒精冲洗腹膜壁
4.2.4 用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动，并促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放，形成细胞悬液。
4.2.5用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。
4.2.6小心拔出针头，把腹腔液注入预冷的培养瓶内。
4.2.7常规计数细胞。
每只鼠可产生2~ 3×106/ml细胞，其中90%为巨噬细胞。
取少量细胞悬液做Giemsa染色，在光镜下观察以鉴定是否是巨噬细胞。
4.3巨噬细胞的纯化
将细胞悬液于4℃、1000r/min离心10min,弃上清,放入培养瓶中，将培养瓶中细胞用4℃D-Hanks液洗2次,再用RPMI1640培养液于37℃、5% CO2 下培养2h,弃上清,用D-Hanks 液洗涤2次以洗去未贴壁细胞,贴壁的细胞则主要是巨噬细胞。
然后换下培养用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液培养继续培养，此时将得到接近纯净的巨噬细胞。
4.4巨噬细胞的接种和培养
将纯化的巨噬细胞培养瓶快速冷冻至2℃，待细胞收缩后猛摇或吹打培养瓶，使巨噬细胞从瓶壁上脱落下来（Castranova et al.1996）。
制成细胞悬液后，计数并调节细胞密度。
以2×105 ～4×105个/cm2的密度接种细胞于12孔培养板内，加入适量RPMI1640培养液后置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液，以备用。
4.5巨噬细胞的鉴定
取培养板内任意一孔细胞用Gomori酸性磷酸酶（ACP）铅法染色，细胞呈阳性反应，ACP 活性颗粒呈棕黑色，则可以断断是巨噬细胞，光镜下计数200个细胞求出阳性率。
4.6巨噬细胞吞噬功能的检测:
在巨噬细胞接种和培养过程中，取适量巨噬细胞悬液放入培养瓶中，加入1%鸡红细胞悬液,37℃孵育2h,甲醇固定细胞涂片,吉姆萨染色,显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况。
计数100个巨噬细胞,计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100(所观察的巨噬细胞数) ×100%。
吞噬指数=100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/100(所观察的巨噬细胞数)。