病毒保存液方法
新冠病毒是如何用病毒保存液进行过程保存的
病毒保存液在核酸标本保存过程中起到了什么作用？核酸检测假阳性、假阴性的问题一直是专家们的心头病，而核酸标本的采集和保存成为影响检测结果的重中之重，很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本，为了提高检测阳性率，建议采集同一病人多部位标本，合并进行检测，下面我们来看看标本在采集、运输、保存过程中应该注意哪些问题。
口、咽拭子采集注意事项1.不要从鼻孔或扁桃体上采样2.不建议雾化导痰3. 下呼吸道标本（相对于上呼吸道标本）更可能呈阳性4.对于怀疑患感染新型冠状病毒的患者，特别是肺炎或严重疾病的患者，单个上呼吸道标本不能排除诊断，建议增加上呼吸道和下呼吸道标本。
病毒保存液标本采集方法：用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。
如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。
标本运输及保存条件:2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。
严格来讲标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。
标本在常温条件下放置时间过长，也可能是造成最后检测结果假阴性的原因，如果因为特殊需要需要长时间保存的话，可以用病毒保存液来保存RNA病毒样本，此外还可以使用防止病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。
总的来说，标本采集后应及时送检，及时检测，如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将采样后的拭子放入病毒保存液中,病毒保存液是病毒采样管内添加的用于保护病毒样本的保护性液体！。
一种病毒样本RNA保存液及其制备方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011391579.0(22)申请日 2020.12.02(71)申请人 苏州海狸生物医学工程有限公司地址 215123 江苏省苏州市工业园区华云路1号东坊产业园B区4号楼(72)发明人 任辉 付监贵 (74)专利代理机构 苏州华博知识产权代理有限公司 32232代理人 何蔚(51)Int.Cl.C12Q 1/24(2006.01)(54)发明名称一种病毒样本RNA保存液及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种病毒样本RNA保存液及其制备方法，其中保存液包括以下组分：Tris ‑HCl、乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X ‑100、柠檬酸钠；其中主要成分乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸的浓度为1mM～10mM，硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠的浓度为0.1M～2M/(m/v)，曲拉通X ‑100的浓度为0.1％～2％(v/v)。
采用本发明制备的病毒样本RNA保存液成本低廉的同时，能够有效避免室温下病毒样本RNA降解，保护病毒RNA长达一周。
本发明保存液可应用于拭子、唾液样本中新型冠状病毒和其他病毒RNA的保存；采用本发明保存液的样本可适用于磁珠法提取实现RNA自动化提取，亦可适用于一步法专用PCR试剂盒直接进行病毒RNA扩增。
权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 112626166 A 2021.04.09C N 112626166A1.一种病毒样本RNA保存液，其特征在于包括以下组分Tris ‑HCl、乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X ‑100、柠檬酸钠。
2.根据权利要求1所述的病毒样本RNA保存液，其特征在于，主要成分包括乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X ‑100。
病料的保存
病料的保存
病料采取后，如不能立即检验，或需送往有关单位检验，应当加入适量的保存剂，使病料尽量保持新鲜状态。
1．细菌检验材料的保存将采取的脏器组织块，保存于饱和的氯化钠溶液或30％甘油缓冲盐水溶液中，容器加塞封固。
如系液体，可装在封闭的毛细玻管或试管运送；饱和氯化钠溶液的配制法是：蒸馏水l00ml，氯化钠38～39g，充分搅拌溶解后，用数层纱布过滤，高压灭菌后备用。
30％甘油缓冲盐水溶液的配制法是：中性甘油30ml，氯化钠牛5g，碱性磷酸钠l 0g，加蒸馏水至l00ml，混合后高，压灭菌备用。
2．病毒检验材料的保存将采取的脏器组织块，保存于50％甘油缓冲盐水溶液或鸡蛋生理盐水中，容器加塞封固，50％甘油缓冲盐水溶液的配制法是：氯化钠2．5g，酸性磷酸钠0．46g，碱性磷酸钠10．74g，溶于l00ml中性蒸馏水中，加纯中性甘油150ml，中性蒸馏水50ml，混合分装后，高压灭菌备用。
鸡蛋生理盐水的配制法是：先将新鲜的鸡蛋表面用碘酒消毒，然后打开将内容物倾入灭菌容器内，按全蛋9份加入灭菌生理盐水1份，摇匀后用灭菌纱布过滤，再加热至56～58℃，持续30min，第2天及第3天按上法再加热一次，即可应用。
3．病理组织学检验材料的保存将采取的脏器组织块放人10％福尔马林溶液或95％酒精中固定；固定液的用量应为送检病料的10倍以上。
如用10％福尔马林溶液固定，应在24h后换新鲜溶液一次。
严寒季节为防病料冻结，可将上述固定好的组织块取出，保存于甘油和10％福尔马林等量混合液中。
病毒核酸保存液的特点及使用方法
病毒检测的过程可以简单总结为取样、留样、保存、核酸提取、检测等五个步骤，取样的过程是用咽拭子擦拭咽后壁及双侧扁桃体处各5-10次，还要不断旋转咽拭子。取样完成后要马上将拭子浸入细胞保存液中，并折断尾部立即旋紧试管盖。然后再将样本试管放入密封袋中送检，在这个过程中需要在2-8℃中保存。检测时先将病毒灭活后进行核酸提取，最后进行荧光PCR扩增反应和核酸检测。整个过程需要约6小时，如果第一次检测结果“阳性”，还需要再重复操作一次进行复核，所以一份阳性报告至少需要12小时。
核酸提取时先融化如果已经冻凝然后把拭子挤出液体弃拭子液体当成裂解液使用后续处理不需要再加裂解液只需要加上柱液即可上柱洗涤洗脱过程按核酸纯化试剂盒即可
病毒核酸保存液的特点及使用方法
病毒核酸保存液它用于流感病毒、手足口病毒、麻疹风疹病毒、冠状病毒等各种病毒。它可在快速灭活病毒和酶的活性，同时能保护病毒的核酸在常温下 4 天不降解，方便样品的运输。
4. 含有特殊的核酸保护和稳定试剂，可以保护释放出来的病毒DNA和病毒RNA在常温下4 天内无明显的降解。
5. 可用于各种拭子样品，包括口腔拭子、咽喉拭子、鼻腔拭子、阴道拭子等等。
6. 保存的样品可以在常温运输，尤其适用于远距离采样和运输。
7. 本试剂盒一次采样可以进行5次核酸提取（如果使用柱式病毒RNAout或柱式病毒 DNAout）。
3. 速将拭子放入本采样管中（含病毒运输液）。
4. 将采样拭子在折断处折断，旋紧管盖。
5. 新鲜采集的临床标本应在 4℃-常温下 96 小时内运送至实验室，未能 96 小时送至实验室的，应置于-70℃或以下保存。标本送至实验室后应尽快进行核酸提取， 24 小时内能进行核酸提取的可置于 4℃保存，如不能则应置于-70℃或以下保存。
关于病毒的液氮罐超低温保存法介绍
关于病毒的液氮罐超低温保存法介绍大多数微生物都可以用超低温来保存，超低温保存法是适用范围最广泛的微生物保存法。
需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC1983；Halliday，Baker1985）。
此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。
超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。
ATCC常用一种由甘油（10％）、二甲亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。
这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。
贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。
当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。
只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。
超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。
在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。
这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。
1材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（NuncCryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。
2方法（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm的热收缩塑料管。
（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。
（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。
（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。
注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。
（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。
（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。
病毒保存液标本采集方法
病毒保存液标本采集方法
一、预期用途：
本产品适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作。
可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。
二、采集方法：
1 .咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
2. 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
3. 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。
图示试子保存及试子种类
一次性使用病毒采样管用途：
1、用于疾控部门、临床部门对传染病原微生物监测采样使用。
适用于流感病毒（普通流感、高致病性禽流感、甲型H1N1流感病毒等）、手足口病毒及其他类型的病毒采样。
同时也用于支原体、衣原体、脲原体等的采样。
2、用于从采样现场到检测实验室运送鼻咽拭子标本或特定部位的组织标本，以待进行PCR提取与检测。
3、用于保存鼻咽拭子样本或特定部位的组织标本，以待进行必要的细胞培养。
病毒保存液中EDTA和tris的作用
EDTA、Tris、病毒保存液在病毒检测中的应用新冠病毒全球肆虐的环境下，如何快速检查并隔离阳性感染者在控制疫情的作用就不言而喻了。
在目前流行的标本采集与处理方法中，EDTA、Tris、病毒保存液在不同的阶段发挥着重要作用。
这里做一个简要梳理。
鼻咽拭子：采样器用一只手轻轻握住人的头部，拭子插入另一种，通过鼻孔插入拭子进入，沿着下鼻梁的底部慢慢变深。
因为鼻管是弯曲的，所以不要用力过猛，以免造成外伤性出血。
什么时候拭子的尖端到达鼻咽腔的后壁，轻轻旋转一次（如果出现反射性咳嗽，请稍等片刻），然后慢慢取出药签并将药签的尖端浸入装有2-3ml病毒保存液（或等渗盐溶液，组织培养液）的试管。
粪便标本：取1ml样品处理液，取大约一个大小的样品。
粪便标本处理溶液可以在实验室内部制备：1.211g tris，8.5g 氯化钠，1.1克无水氯化钙或1.47克含结晶的氯化钙水，溶于800毫升去离子水中。
以8,000rpm离心5分钟，吸收上清液保留使用。
肛门拭子：将消毒棉签轻轻插入肛门深3-5厘米，然后轻轻旋转并拉出，立即将拭子放入15毫升螺口盖采样管中包含3-5ml病毒保存溶液，丢弃尾巴并拧紧管盖。
血液样本：建议使用含有EDTA抗凝剂的真空血管收集5ml血液样本。
核酸提取应在全血或血浆中进行根据核酸提取试剂的类型选择。
对于血浆分离，整个血液应以1,500至2,000 rpm离心10分钟，然后将上清液收集在带螺帽的无菌塑料管中。
血清标本：用真空负压血液采集5毫升血液标本收集管。
将标本在室温下放置30分钟，在1,500-2,000的范围内离心 rpm 10分钟，并在带螺帽的无菌塑料管中收集血清。
其他材料：根据设计要求以标准化的方式收集。
采样管内病毒保存液介绍
采样管内病毒保存液介绍病毒采样拭子是常用的病毒采样方法与PCR相结合可以用于快速病毒性疾病的检测。
但是，并不是每个样品采集处都能进行PCR检测，因此需要对采集到的病毒拭子样品进行运输，于是拭子病毒保存液应运而生。
病毒由一种核酸分子与蛋白质构成或仅由蛋白质构成，个体微小、结构简单，常见的流行传染病通常是RNA病毒，如流感病毒、艾滋病毒、甲流病毒。
由于没有细胞结构，病毒自身不能复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统复制新的病毒。
病毒样本采集后，为了维持病毒样本的活性、延长样本中病毒存活时间，会将采样拭子放入保存液中保存、运输。
病毒保存液（灭活型）采用高浓度的胍盐可以快速对呼吸道病原体进行灭活、保存，使样品失去感染性。
已灭活的样品可配套使用多种病毒DNA/RNA提取试剂盒，M32/M96核酸提取仪快速提取核酸，同时配合呼吸道病原体PCR检测试剂盒实现快速检测，特异性灵敏度均不受影响。
病毒保存液具有许多功能：1.操作简单无需配液,体系内含有高效病毒裂解液,采样后即刻灭活病毒,有效防止二次感染风险。
2.内含核酸Rnase酶抑制剂,更大化程度保护病毒核酸稳定不被降解,大幅提高核酸提取效率。
3.产品采样前可常温保存12个月,采样后样本可常温保存一周,密闭性好,方便保存运输,节省运输成本。
除以上灭活型的病毒保存液外，还有非灭活的病毒保存液，含有Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA(V),冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等。
多种抗生素联合，具有抗细菌和抗真菌的作用；牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质稳定剂，可在病毒的蛋白质外壳形成一种保护膜，使其不易分解，保证病毒的完整性；Hanks缓冲液构建的中性环境，有助于增加病毒的生存时间和感染稳定性。
非灭活的病毒保存液通常用于临床流感、禽流感(如H7N9)、手足口病、麻疹等病毒标本及支原体、脲原体、衣原体等标本的采集及运送。
德晟科技自2005年以来一直致力于样品采集与体外诊断方面的研究与相关原料的生产销售，采血管添加剂、病毒保存液、生物缓冲剂等产品在国内外都广受好评！。
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原液A
NaCI 160g
MgS04 7H2O 2g
KCI 8g
Mg CI2 -6H2O 2g
CaCI2 2.8g
溶于1000ml双蒸水
原液B
（1）Na2HPO4 12H2O 3.04g KH2PO4 1.2g
葡萄糖20.0g
溶于800ml双蒸水
（2）0.4%酚红溶液：取酚红0.4g，置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH，并研磨，直至完全溶解，约加0.1N NaOH 10ml。
将溶解的酚红吸入100ml量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留酚红液，并入量瓶中，最后补加双蒸水至100ml。
将（1）液和（2）液混合，补加双蒸水至1000ml，即为原液B o
应用液
原液A 1份
原液B 1份
双蒸水18份
混合后，分装于200ml小瓶中，10磅高压蒸气
灭菌15分钟，临用前用无菌的 5.6% NaHCO3
调pH 至7.2〜7.6（7g）
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