聚酰胺柱层析
柱层析的分离原理和分离步骤
柱层析的分离原理和分离步骤：
柱层析是一种广泛应用于化学和生物学领域中的分离技术，其基本原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等，使各组分在固定相和流动相之间进行不同的分配和移动速度，从而达到分离的目的。
在柱层析中，固定相通常是由不溶性基质形成，如硅胶、大孔吸附树脂、聚酰胺等，而流动相则是由溶剂组成。
样品被加到柱子上后，用流动相洗脱，在洗脱过程中，样品中的各组分根据其在固定相和流动相中的分配系数不同，经历多次反复的吸附、解吸、再吸附、再解吸过程，最终实现分离。
柱层析的操作方式主要包括常压分离、减压分离和加压分离，其中，常压分离是最简单的分离模式，适用于大于50-100g的产品，但洗脱时间较长；减压分离可以节省填料的使用量，但由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，且有时易分解的化合物难以得到；加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间。
柱层析分离芦丁和槲皮素以及聚酰胺TLC鉴定芦丁和槲皮素
二、实验原理
• 2）. 展开剂的极性较小（脂溶性溶剂所占 比例>50%）时，如：苯：丁酮：甲醇 = 60： 20：20; 洗脱先后顺序: • 极性小的先洗脱，极性大的后洗脱。 • 用正相色谱理论来解释。
二、实验原理
• 二）．黄酮苷元之间的比较： • 用氢键吸附的原理来解释。
二、实验原理
• 本实验利用聚酰胺在乙醇-水系统中，洗 脱原理与RP-18的洗脱原理类似，因此，芦 丁先从聚酰胺柱上洗脱出来，槲皮素后从 聚酰胺柱上洗脱出来。
三．实验操作步骤
• 4. 收集 • 5. 检测 用试管收集，每试管接收10 ml。 分离结果用TLC检测。
（二）芦丁和槲皮素聚酰胺色谱柱层析后的 试样进行聚酰胺薄膜层析操作
• 1. 配制展开剂，甲醇：丙酮：苯＝8：1：1 • 2. 将展开剂倒入展开缸中，展开缸中展开剂 的高度4mm左右。 • 3. 画基线，基线距底边1.0～1.5cm； • 4. 点样（点样顺序：试样1、试样2、芦丁、 槲皮素)，点样一般为圆点，点样直径一般不 大于2 mm，点样时必须注意勿伤薄层表面。
（二）芦丁和槲皮素聚酰胺色谱柱层析后的 试样进行聚酰胺薄膜层析操作 • 5. 倾斜展开缸，使展开剂到入展开缸的另 一个槽中，聚酰胺薄膜浸入展开剂的深度 为距圆点5 mm为宜，一般展距为8 cm,取出 薄层板，晾干。 • 6. 喷1％的AlCl3显色。 • 7. 实验结果见图1。
四．体会与讨论
• 1. 画出聚酰胺薄膜层析鉴定芦丁和槲皮素 分析图
实验四 柱层析分离芦丁和槲皮素以 及聚酰胺TLC鉴定芦丁和槲皮素
一 、实验目的
• 掌握用聚酰胺柱层析分离芦丁和槲皮素 的方法。
二、实验原理
1. 槲皮素与芦丁的结构
聚酰胺柱层析法分离回心草总黄酮的研究
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聚酰胺柱色谱分离黄酮类化合物的规律
聚酰胺柱色谱分离黄酮类化合物的规律聚酰胺柱色谱（Polyamide column chromatography，简称PAC）是一种重要的分离技术，广泛应用于天然产物、植物提取物以及药物中化合物的分离与纯化。
实验表明，聚酰胺柱色谱可以有效地分离黄酮类化合物，而且不同的黄酮化合物在PAC柱中的分离特性也不尽相同。
本文将从PAC的原理、方法及黄酮类化合物的分离规律三个方面，介绍聚酰胺柱色谱分离黄酮类化合物的规律。
一、PAC的原理及方法聚酰胺柱色谱的原理是基于化合物与聚酰胺的相互作用，即两者之间的互相吸附作用。
聚酰胺中嵌段的活性基团可与多种化合物相互作用，包括氢键、范德华力、离子作用和疏水作用等。
通过这种相互作用，化合物在聚酰胺柱上的保留时间差异越大，分离效果越好。
PAC柱是由聚合酰胺固相填充于柱中，分离过程中，样品先与PAC柱顶部的Kimwipe垫子接触，样品中的化合物会逐渐向下通过柱内填料，根据其与聚酰胺的相互作用特点，被逐渐保留在柱内特定位置，最终得出纯度较高的单一化合物。
二、黄酮类化合物的分离规律黄酮类化合物的共同结构为苯并吡喃的基团，不同的化合物则在苯基和吡喃环上有不同的取代基。
通过PAC技术可以有效地分离不同取代基的黄酮化合物。
1. 垂直几何构型对化合物分离的影响尽管PAC柱中的聚酰胺分子为无规共聚物，但其分布具有特定的规律性。
其中，聚酰胺分子的垂直几何构型对化合物分离的影响较大。
实验表明，长-长纤维型柠檬酸酯类黄酮在PAC柱中得到了良好的分离，说明这类黄酮分子能够与形成长纤维状结构的分子发生相互作用，为其分离提供了可能。
2. 取代基对化合物分离的影响苯基和吡喃环上不同位置的取代基会影响化合物的互相作用特点，从而影响它们在PAC柱上的分离。
以黄酮类化合物为例，不同的取代基类型及其位置对化合物的分离具有重要影响。
（1）糖基的影响黄酮类化合物中，不少化合物上有糖基取代，这类糖基会影响化合物的保留时间，也会影响化合物的选择性。
天然药物化学：实验四 柱层析分离芦丁和槲皮素以及聚酰胺TLC鉴定芦丁和槲皮素
三．实验操作步骤
• 4. 收集 用试管收集，每试管接收10 ml。 • 5. 检测 分离结果用TLC检测。
（二）芦丁和槲皮素聚酰胺色谱柱层析后的 试样进行聚酰胺薄膜层析操作
• 1. 配制展开剂，甲醇：丙酮：苯＝8：1：1 • 2. 将展开剂倒入展开缸中，展开缸中展开剂
1. 槲皮素与芦丁的结构
HO
O
OH OH
OH
OH
O
槲皮素
HO
O
OH OH
O Glc Rha
OH
O
芦丁
二、实验原理
• 根据聚酰胺的“双重功能”来进行分离。 • 一）．比较黄酮苷 • 1. 展开剂的极性较大（水溶性溶剂所占比
例>50%）时，如：含水醇或水：甲醇：丁 酮：乙酰丙酮=65：15：15：5; 洗脱先后 顺序: • 三糖苷>双糖苷>单糖苷>苷元 • 理论: 用反相色谱理论来解释。
二实验原理?本实验利用聚酰胺在乙醇水系统中洗脱原理与rp18的洗脱原理类似因此芦丁先从聚酰胺柱上洗脱出来槲皮素后从丁先从聚酰胺柱上洗脱出来槲皮素后从聚酰胺柱上洗脱出来
实验四 柱层析分离芦丁和槲皮素以 及聚酰胺TLC鉴定芦丁和槲皮素
一 、实验目的
• 掌握用聚酰胺柱层析分离芦丁和槲皮素 的方法。
二、实验原理
二、实验原理
• 2）. 展开剂的极性较小（脂溶性溶剂所占 比例>50%）时，如：苯：丁酮：甲醇 = 60： 20：20; 洗脱先后顺序:
• 极性小的先洗脱，极性大的后洗脱。 • 用正相色谱理论来解释。
二、实验原理
• 二）．黄酮苷元之间的比较： • 用氢键吸附的原理来解释。
聚酰胺柱层析.
大，使聚酰胺粉浮在上面，加样时应将柱底端的氯仿层放出，
并立即加样，加样后顶端以棉花塞紧，在层析关闭时，应将 顶端的多余氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层析带。
4. 操作步骤
• 4.2 上样：一般每100ml聚酰胺上样1.5-2.5g，可根据具体 情况适当增加或减少。若利用聚酰胺除去鞣质，样品上柱 量可大大增加，通常观察鞣质在柱上形成的橙红色色带的
移动，当样品加至该色带移至柱的近底端时，停止加样。
样品先用洗脱溶剂溶解，浓度为20%-30%。水溶性化合物 直接上样；若提取物水溶性不好，则用挥发性有机溶媒溶 解、拌适量聚酰胺、挥干或减压蒸干、干法装入柱顶。
4. 操作步骤
• 4.3 洗脱：聚酰胺层析的洗脱剂常采用水－乙醇（10％、 30％、50％、70％、95％），氯仿－甲醇（19:1，10:1， 5:1，2:1，1:1）依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采
③ 分子中芳香化程度越高，则吸附性越强；反之，则减弱。
④ 聚酰胺与物质的氢键缔合能力在水中最强，在含水醇中则
随着醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其它有机溶
剂中则几乎不缔合。 ⑤ 强酸或强碱均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合。
2. 分离原理
• 2.2 分离机理 • 2.2.1 “氢键吸附”学说 • 溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合的能力越 强,则聚酰胺对这两种化合物的吸附作用将越弱。聚酰胺 层析柱即是利用此性质对各种植物中黄酮、茶多酚等进行
于吸附层析，不是分配层析。因此，“双重层析理论”也 没有揭示出产生这两种相反现象的根本原因。
2. 分离原理
• 2.3 洗脱机理 • 聚酰胺分子中有极性酰胺基团和非极性的脂肪键。作为一 个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂(如水、 乙醇、丙酮等)时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行 为类似反相分配层析，极性较大的吸附物易被洗脱。随着
聚酰胺柱层析法
聚酰胺柱层析法
聚酰胺柱层析法是一种高效液相层析法（HPLC）的一种变体，用于分离和分析样品中的化合物。
层析柱由聚酰胺制成，内径可根据需要选择。
该方法通常用于分离极性化合物。
聚酰胺柱层析法的原理是根据化合物在移动相和固定相之间的差异来分离化合物混合物。
移动相是可以在柱中移动的溶剂，在不同的条件下可以改变移动相的极性。
固定相是柱填充物，表面上有活性位点，可以与化合物发生相互作用。
该方法的步骤包括样品预处理，准备HPLC设备，选择合适
的柱和填充物，制备移动相，样品注入柱中，运行HPLC设备，并检测和分离化合物。
聚酰胺柱层析法在许多领域中得到广泛应用，包括药物分析、环境分析、食品分析等。
它具有高分辨率、高灵敏度、高重复性和高选择性的优点。
聚酰胺层析原理是
聚酰胺层析原理是
聚酰胺层析是一种基于吸附分离原理的分离技术。
它利用聚酰胺材料的特殊结构和吸附性质，将混合物中的成分分离出来。
聚酰胺层析的原理如下：
1. 吸附性质：聚酰胺材料具有一定的吸附性质，可以与混合物中的某些成分发生相互作用，如氢键、范德华力等。
不同成分与聚酰胺的吸附性质不同，导致它们在聚酰胺上停留时间和迁移速度不同。
2. 成分分离：将混合物通过聚酰胺填充柱或薄层，混合物中的成分会和聚酰胺发生相互作用并被吸附。
不同成分在聚酰胺上的吸附程度不同，一些成分会被聚酰胺更强烈地吸附，停留时间较长，而另一些成分则较快地迁移。
3. 逐渐洗脱：根据不同成分在聚酰胺上的吸附性质，通过调节洗脱剂的溶液条件（如pH值、离子浓度等），逐渐洗脱被吸附的成分。
这样可以将不同的成分逐一分离出来。
聚酰胺层析原理的关键在于利用聚酰胺与不同成分之间的相互作用差异来实现分离，从而实现混合物的分离纯化。
聚酰胺层析在药物、生物制药、环境监测等领域有着广泛的应用。
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5. 聚酰胺应用中的问题
• 5.2 当含甲醇的溶剂洗脱时，往往所得到的黄酮类化合物 中含有低分子量的聚酰胺。故可用50%甲醇水溶液预先洗 涤除去。
随着醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其它有机溶 剂中则几乎不缔合。 ⑤ 强酸或强碱均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合。
2. 分离原理
• 2.2 分离机理 • 2.2.1 “氢键吸附”学说 • 溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合的能力越
强,则聚酰胺对这两种化合物的吸附作用将越弱。聚酰胺 层析柱即是利用此性质对各种植物中黄酮、茶多酚等进行 吸附、洗脱而分离的。
4. 操作步骤
• 4.1 装柱：一般将颗粒状聚酰胺混悬于水中，使其充分膨胀， 然后装柱，让聚酰胺自由沉降；当用非极性溶剂系统时候， 则用组分中低级性的溶剂装柱。若以氯仿装柱，因其比重较 大，使聚酰胺粉浮在上面，加样时应将柱底端的氯仿层放出， 并立即加样，加样后顶端以棉花塞紧，在层析关闭时，应将 顶端的多余氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层析带。
3. 前处理
• 3.2 用过的聚酰胺 一般用5%NaOH水溶液洗脱，洗至NaOH水溶液颜色极淡 为止。有时因某些鞣质与聚酰胺又不可逆吸附，用NaOH 水溶液很难洗脱，可用5%NaOH在柱中浸泡，每天将柱中 的NaOH水溶液放出一次，并加入新的5%NaOH水溶液， 这样浸泡一周后，鞣质可基本洗脱完。然后用蒸馏水洗脱 至pH8-9，再用2倍量的10%醋酸水溶液洗脱，最后蒸馏水 洗脱至pH中性，重复使用。
4. 操作步骤
• 4.3 洗脱：聚酰胺层析的洗脱剂常采用水－乙醇（10％、 30％、50％、70％、95％），氯仿－甲醇（19:1，10:1， 5:1，2:1，1:1）依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采 用3.5％氨水洗脱。洗脱剂的更换，一般根据流出液的颜 色，当颜色变为很淡时更换下一种溶剂，并以适当体积分 瓶收集，分瓶浓缩。各瓶浓缩液以聚酰胺薄膜层析检查其 成分，成分相同者合并。再进入下一步纯化。
聚酰胺柱层析
目录
• 什么是聚酰胺? • 分离原理 • 前处理 • 操作步骤 • 聚酰胺应用中的问题
1. 什么是聚酰胺
• 聚酰胺(Polyamide)是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化 合物，层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的 尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66。
• 聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机 溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶 于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。
2. 分离原理
• 2.2.2 “双重层析”理论 • 当用极性流动相(含水溶剂系统)洗脱时，聚酰胺作为非极
性固定相，其层析行为类似反相分配层析，当用有机溶剂 洗脱时，聚酰胺作为极性固定相，其层析行为类似正相分 配层析。但固定相(吸附剂)的极性是由其本身结构及性质 决定的，不应随洗脱液的改变而改变，况且聚酰胺层析属 于吸附层析，不是分配层析。因此，“双重层析理论”也 没有揭示出产生这两种相反现象的根本原因。
3. 前处理
• 3.1 新买的聚酰胺 取聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入 柱中。用3-4倍体积的90-95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明 并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2-2.5倍体积 5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的10% 醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用。
4. 操作步骤
• 4.4 找到最佳吸附比：先小量试验找到最佳吸附比。 • 4.5 放大：根据小试及最佳吸附比进行放大试验。 • 4.6 聚酰胺的回收：使用过的聚酰胺一般用5%氢氧化钠溶
液洗涤，然后水洗，再用10%醋酸液洗，然后用蒸馏水洗 至中性，即可。有文献报道聚酰胺可反. 分离原理
• 2.1 吸附机理 • 聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键(-CO-NH-)的高分
子聚合物， 酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子 而带正电荷，以静电引力形成吸附溶液中的阴离子，故可与 酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基的化合物形成氢键 而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。
4. 操作步骤
• 4.2 上样：一般每100ml聚酰胺上样1.5-2.5g，可根据具体 情况适当增加或减少。若利用聚酰胺除去鞣质，样品上柱 量可大大增加，通常观察鞣质在柱上形成的橙红色色带的 移动，当样品加至该色带移至柱的近底端时，停止加样。 样品先用洗脱溶剂溶解，浓度为20%-30%。水溶性化合物 直接上样；若提取物水溶性不好，则用挥发性有机溶媒溶 解、拌适量聚酰胺、挥干或减压蒸干、干法装入柱顶。
2. 分离原理
固定相
CH2 NH
OC CH2
CH2 CH2
CH2 CH2
HN CO
CH2
CH2 OC
NH CH2
CH2 CH2
CH2 CH2
CO HN
CH2
O
O
HO
移动相
2. 分离原理
• 吸附规律 ① 形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。 ② 易形成分子内氢键者在聚酰胺上的吸附相应减弱。 ③ 分子中芳香化程度越高，则吸附性越强；反之，则减弱。 ④ 聚酰胺与物质的氢键缔合能力在水中最强，在含水醇中则
2. 分离原理
• 2.3 洗脱机理 • 聚酰胺分子中有极性酰胺基团和非极性的脂肪键。作为一
个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂(如水、 乙醇、丙酮等)时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行 为类似反相分配层析，极性较大的吸附物易被洗脱。随着 洗脱剂极性降低，极性较小的化合物可相继被洗脱下来。