实用柱层析技术
层析柱柱效
层析柱柱效层析柱柱效是一种用于分离和分析混合物的技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
本文将介绍层析柱柱效的原理、应用和发展趋势。
一、层析柱柱效的原理层析柱柱效是基于层析技术的一种分离方法，它利用不同物质在固定相和流动相之间的相互作用力差异来实现分离。
层析柱柱效中，两根柱子分别填充不同的固定相，流动相从两根柱子的顶部进入，经过固定相的作用，不同组分被分离出来，并从两根柱子的底部分别收集。
层析柱柱效的分离原理主要包括吸附、离子交换、分配和凝胶渗透等。
吸附层析柱柱效是利用固定相对样品中的目标物质具有吸附作用，实现目标物质的分离。
离子交换层析柱柱效则是通过样品中的离子与固定相上的离子交换，实现目标物质的分离。
分配层析柱柱效是利用样品中的目标物质在两个不同的相中分配比例不同，实现目标物质的分离。
凝胶渗透层析柱柱效是利用固定相的孔隙大小选择性地限制目标物质的渗透，实现目标物质的分离。
层析柱柱效在化学、生物、环境等领域具有广泛的应用。
在化学领域，层析柱柱效被广泛用于有机合成中的分离纯化、药物分析、天然产物提取等。
在生物领域，层析柱柱效被广泛应用于蛋白质纯化、酶活性分析、基因组分离等。
在环境领域，层析柱柱效被广泛用于水质分析、土壤污染物检测等。
层析柱柱效具有分离效果好、分离速度快、操作简单等优点，因此得到了广泛的应用。
同时，层析柱柱效也存在一些挑战和问题，如样品复杂性、固定相选择、柱效和流量控制等方面的优化。
因此，不断改进和发展层析柱柱效技术对于提高分离效果和提高分析速度具有重要意义。
三、层析柱柱效的发展趋势随着科学技术的不断发展，层析柱柱效也在不断演进和改进。
一方面，新型的固定相材料不断涌现，如疏水相、亲水相、离子交换相等，可以更好地适应不同样品的分离需求。
另一方面，自动化和智能化的层析柱柱效设备也不断出现，实现了对流动相、柱效、流量等参数的精确控制，提高了分析的准确性和稳定性。
层析柱柱效与其他分离技术的结合也是未来的发展方向。
柱层层析法
柱层层析法1. 什么是柱层层析法柱层层析法（Column Chromatography）是一种分离和纯化化合物的常用技术。
它基于化合物在固定相（柱层）和移动相（溶剂）之间的不同亲和性，通过不同程度的分配来实现分离。
2. 柱层层析法的原理柱层层析法的原理基于化合物在柱层中的分配行为。
柱层通常由多孔性固体填充而成，填充物可以是硅胶、氧化铝或其他吸附剂。
移动相则是溶剂，可以是单一溶剂或溶剂混合物。
当样品溶液经过柱层时，不同的化合物会因其与固定相的亲和性不同而以不同速度移动。
较亲和固定相的化合物会被较牢固地吸附在柱层上，而较亲和移动相的化合物则会更快地通过柱层。
这样，化合物就会在柱层中被分离开来。
3. 柱层层析法的步骤柱层层析法通常包括以下步骤：3.1. 准备柱层首先，选择合适的柱层填充物，并将其装填到柱层中。
填充物的选择应根据化合物的性质和需求进行，常用的填充物有硅胶和氧化铝。
3.2. 平衡柱层将柱层与移动相进行平衡，使填充物充分吸附溶剂。
3.3. 样品加载将待分离的化合物样品溶液加载到柱层的顶部。
注意，样品溶液应预先与移动相进行适当的预处理和溶解。
3.4. 洗脱化合物通过逐步改变移动相的组成或使用不同的移动相，将化合物从柱层中洗脱出来。
洗脱时应注意控制溶剂流速和溶剂比例，以保证化合物的有效分离和纯化。
3.5. 收集洗脱液将洗脱液收集起来，通常使用试管或收集瓶。
根据需要，可以将收集的洗脱液进行进一步处理和分析。
4. 柱层层析法的应用柱层层析法广泛应用于化学、生物化学和制药领域。
它可以用于分离和纯化天然产物、合成化合物、蛋白质和核酸等多种化合物。
4.1. 天然产物的提取与纯化柱层层析法可以用于从天然产物中提取和纯化目标化合物。
通过合理选择填充物和移动相，可以实现对复杂混合物中目标化合物的高效分离和纯化。
4.2. 合成化合物的纯化柱层层析法也常用于合成化合物的纯化。
通过柱层层析，可以将化学反应的产物与副产物分离开来，从而获得纯度较高的目标化合物。
常用的柱层析方法
常用的柱层析方法体积排阻（Size Exclusion）层析也称分子筛、凝胶过滤层析或凝胶渗透层析。
其工作原理是利用蛋白质分子量或分子外形的差异实现分别。
体积排阻层析柱的柱床由多孔介质填料组成，当样品从层析柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒而快速洗脱，小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒内，其在凝胶内部的迁移被延迟。
因此，蛋白质从柱中被洗脱的挨次普通按分子量由高到低。
体积排阻层析主要用来从蛋白质溶液中去除低分子量的缓冲液成分和盐。
(1) 挑选适当的层析柱假如需要从复杂原料中将全部较大分子量的分子（如大于5000Da )的物质与小分子（5000Da以下）物质分开，可以挑选排阻极限小的层析柱，如Sephadex G-25填料的柱子；假如要分别相对分子量相差不大的柱子，可按照各种凝胶的排阻范围举行挑选。
固然也可以购买填料自己装柱，但试验结果的重复性、稳定性不如预装柱。
(2）挑选适当的缓冲液了解样品的稳定性，挑选保证样品性质稳定的pH和离子强度的缓冲液。
须要时，可以取少量样品举行测试。
多数状况下可用水作缓冲液，为了避开非特异性吸附或者对于一些在纯水中溶解度较低的蛋白质，常采纳缓冲盐溶液举行洗脱。
对于一些吸附性强的物质也可采纳水和有机溶剂的混合物举行洗脱。
(3）样品的处理样品在上样前普通要举行离心或过滤处理，以去除影响层析柱分别效果的杂质并可防止柱子堵塞。
少量样品普通在1000g离心15 min，细胞裂解液在4000-5000g离心30min，去除脂质和细胞碎片。
挑选过滤的滤膜孔径与填料颗粒的孔径大小相关。
对于与滤膜有非特异性结合的样品，应用离心代替过滤。
(4）上样量为了达到良好的分别效果，上样量必需保持较小的体积，普通为柱体积的2％-5%。
(5）洗脱与收集洗脱过程中应保持流速稳定，不宜过快。
收集时应该按照样品的量和试验的目的挑选适当的组分来收集。
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柱层析实用技巧
详细柱层析技巧常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
特别是在容易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体择要具体分析。
如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
关于柱层析的实验方法和技巧
关于柱层析的实验方法和技巧柱层析是一种广泛应用于分离、纯化和分析复杂混合物的技术。
其基本原理是根据混合物组分的相互作用力的不同，在柱状填料上发生不同程度的分配与吸附，从而使混合物分离成单个或少量组分。
柱层析实验方法主要包括以下步骤：1.选择柱层析填料：根据所需分离的混合物的特性和目的，选择合适的填料。
常用填料有硅胶、反相填料等。
2.准备样品：将待分离的混合物以适当的溶剂溶解，并过滤除去悬浮物。
3.将填料装入层析柱中：将选择好的填料按照提供的方法装入层析柱，并确保填充完全均匀。
4.平衡填料：用适当的洗脱剂通过填料进行平衡，以除去填料表面的杂质和待分离混合物外的其他杂质。
5.加样分析：在柱层析填料上均匀加样，并注意避免柱尾部的重叠现象，以免影响分离效果。
6.洗脱剂流出：用相应的洗脱剂缓慢流过填料层，将待分离的组分逐渐从填料中洗脱出来。
7.采集分离组分：根据所需分离组分的不同，采用不同的方法收集和提取洗脱液中的分离组分。
8.结果分析：通过检测和分析分离得到的组分，确定柱层析的分离效果，并进一步进行定量分析或纯化操作。
柱层析实验中的技巧有：1.选择合适的填料和洗脱剂：填料的选择应考虑到混合物的性质和目的，洗脱剂的选择应使待分离的组分具有较大的差异性。
2.注意填料装填的均匀性：填料装填均匀可以提高柱层析的分离效果和分辨率，避免填料不均匀造成的漏洗现象。
3.适当控制洗脱剂的流速：流速过快会导致分离不彻底，流速过慢则会延长分析时间。
应根据填料和样品特性调整流速。
4.注意样品加样的均匀性：样品加样均匀可以避免出现分离过早或过晚的现象，影响柱层析的分离效果。
5.经常检查柱的状态和泄漏情况：柱层析过程中，需要时常检查柱的状态，如填料是否松动、泄漏等，及时发现和处理问题。
6.根据分离效果调整实验参数：根据分离效果的实际情况，进行必要的参数调整，如填料种类、洗脱剂浓度、流速等。
柱层析法和薄层层析法简介
柱层析法和薄层层析法简介柱层析法和薄层层析法是化学分析中常用的分离和纯化技术。
柱层析法是一种基于样品在固定相和流动相之间的不同亲和性而进行分离的方法，而薄层层析法则是一种基于样品在薄层固定相上迁移的速率差异进行分离的方法。
下面将对这两种方法进行详细介绍。
一、柱层析法：柱层析法主要包括固定相的选择、柱填充、流动相的选择和柱层析实验步骤。
1.固定相的选择：柱层析法的关键在于选择合适的固定相，以实现样品的有效分离。
常见的固定相有硅胶、氧化铝等无机物固定相，以及聚合物固定相。
根据样品的特性和分离目的，可以选择不同性质的固定相。
2.柱填充：选择好固定相后，将其装入柱子中。
柱子的尺寸和形状因具体实验目的而异，可以选择不同规格的柱子。
柱层析时需要一定的流动相经过柱子，使样品发生分离。
3.流动相的选择：流动相在柱层析中起着溶解样品、推动样品迁移的作用。
选择流动相时要考虑其溶解度、极性和挥发性等因素，以满足样品有效分离的需要。
常用的流动相有水、醇、酸和有机溶剂等。
4.柱层析实验步骤：将样品溶解于流动相，注入柱子上方，通过柱子中流动相的推动，样品将被分离。
在柱层析过程中，可以收集不同部分的淋出液，进一步进行定量分析。
二、薄层层析法：薄层层析法是一种简单快捷的分离方法，主要利用样品成分在薄层和流动相之间的差异速率进行分离。
薄层层析法主要包括薄层固定相的选择、样品的制备、样品在薄层上分离和可视化等步骤。
1.薄层固定相的选择：薄层层析法使用具有吸附性能的薄层材料作为固定相，如硅胶、氧化铝等。
根据样品特性和分离目的，可以选择不同性质的薄层固定相。
2.样品的制备：将样品溶解于合适的溶剂中，制备成涂布于薄层板上的样品。
样品的制备需要注意样品的浓度和纯度，以及溶剂的选择和配比。
3.样品在薄层上的分离：将样品涂布在薄层板上后，放置在流动相中，流动相将会迁移样品在薄层上形成的斑点。
样品的分离程度与样品成分的极性、溶剂的性质和薄层固定相的特性有关。
柱层析实验技术范文
柱层析实验技术范文柱层析实验技术是一种广泛应用于分析化学领域的分离技术。
它通过溶液在固定相填充的柱子中的分配行为，将混合物中的分离物分离开来。
柱层析实验技术具有分离效率高、分离速度快、重复性好等特点，被广泛应用于有机合成、药物分析、环境监测等领域。
柱层析的原理主要由平衡原理和分配原理组成。
平衡原理是指在溶液中溶解的物质在固定相和流动相之间建立平衡。
分配原理是指混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配比例与它们之间的平衡常数有关。
柱层析的步骤主要包括填充柱子、装载样品、流动相、洗脱、监测和分析等。
首先，选择适当大小的柱子，并将固定相填充到柱子中。
然后，将样品溶解在流动相中，并将样品装载到柱子中。
接下来，选择合适的流动相，使其在柱子中流动。
通过调整流动相的性质和流速，使各组分在柱子中发生分配。
随后，选择合适的洗脱剂，将目标物质从柱子中洗脱出来。
最后，通过适当的监测方法，如紫外可见光谱、质谱等，对得到的洗脱物进行分析。
常用的柱层析技术主要包括液相柱层析和气相柱层析。
液相柱层析是指以液态为流动相的柱层析技术，主要应用于有机物的分离和分析。
常见的液相柱层析技术有固相萃取柱层析、离子交换柱层析、高效液相柱层析等。
气相柱层析是指以气态为流动相的柱层析技术，主要应用于描写气体或描写性精油的分离和分析。
常见的气相柱层析技术有气相色谱柱层析法、毛细管气相柱层析法等。
在进行柱层析实验时，需要注意实验条件的选择和优化。
选择合适的固定相和流动相、调整流动相的性质和流速、优化柱子的温度条件等都能够提高柱层析实验的分离效果和分离速度。
此外，还需要注意样品的装载量和洗脱剂的选择等因素。
总的来说，柱层析实验技术是一种重要的分离技术，广泛用于分析化学领域。
通过掌握柱层析的原理、步骤和常用技术，能够有效地进行分离和分析工作，为科研和工程实践提供有力支持。
柱层析的实验方法和技巧
此外在采用TLC选择洗脱剂时还应注意：
第一，某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开；极性太大，也分不开。
第二，点不能点得太浓，否则容易重叠，不易判断，因为如果两个点相近的话，一浓就变成一个点了。但也不能太淡，否则含量较少的成分可能斑点模糊或不显出斑点。点样时还应避免损伤薄层。
干法装柱是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（抽真空时间不要太长，以免柱子装的过实，流速过慢而导致扩散），接着是用淋洗剂“走柱子”。干法装柱较方便、快速且溶剂耗量少，但是其分辨率低、柱效差，故适于大量样品的粗步分离。在干发装柱时应注意：不要过分剧烈地震动和敲打侧壁，过分剧烈地震动和敲打侧壁会使得硅胶因自身粒径的不均匀性而产生柱子整体的不均匀。
而把固定相极性小于流动相极性的柱色谱方法称为反相柱层析，常用的流动相为甲醇、水等极性溶剂。较适宜分离极性较高的化合物。
二、凝胶层析——根据物质的分子大小进行分离
凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析等，是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex)，如Sephadex LH-20。
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吸附剂的选择
中性、酸性物质优先试用硅胶分离，如果 效果不好可以使用氧化铝 碱性物质也可以使用硅胶分离，但需要用 三乙胺等碱性物质碱化吸附剂 如果选择氧化铝分离，需要使用氧化铝TLC 板点板，使用硅胶板不能准确选择流动相 体系
吸附剂的选择
吸附剂目数的选择 对于Rf值>0.4的杂质，可以选择目数100~200的 硅胶 对于Rf值在0.2~0.4的，一般用200~300目 对于Rf值在0.1~0.2的，用300~400目 对于Rf值<0.1的，需要更多的吸附剂用量、较小 的流动相体系、较长的时间
乙酸乙酯：石油醚—丙酮：石油醚—二氯甲 烷:(乙酸乙酯)：石油醚—乙酸乙酯：正己烷（价 格贵不推荐） 甲醇：氯仿—甲醇：二氯甲烷—乙醇：二氯甲 烷
比如，有的物质在乙酸乙酯里溶解度很差， 上柱后样品不能有效的溶解在流动相中， 影响分离，可以改用丙酮、二氯甲烷、或 者三种溶剂同时混合使用 比如，使用甲醇：二氯甲烷体系极性较大 时，可以改换乙醇：二氯甲烷体系，就可 能得到较好的分离效果
塔板理论
理论塔板高度越低，在单位 长度色谱柱中就有越高的塔 板数，则分离效果就越好。 决定理论塔板高度的因素有： 固定相的材质、色谱柱的均 匀程度、流动相的理化性质 以及流动相的流速等。
塔板理论
塔板理论是基于热力学近似的理 论，在真实的色谱柱中并不存在 一片片相互隔离的塔板，也不能 完全满足塔板理论的前提假设。 塔板理论虽然能很好地解释色谱 峰的峰型、峰高，客观地评价色 谱柱地柱效，却不能很好地解释 与动力学过程相关的一些现象， 如色谱峰峰型的变形、理论塔板 数与流动相流速的关系等。
A B
基本操作程序
清洗砂芯， 检查柱子 装柱：干法， 湿法 上样：干法， 湿法
洗脱：根据TLC 情况配置洗脱液
收集：检测 方法选择
使用常压或减压蒸馏， 冻干等方法除去溶剂
装柱
干法
直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧， 至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度， 最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。 接着是用洗脱剂“走柱子”，一般洗脱剂是采用TLC 分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面 加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较 方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶 之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产 生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲 烷更为明显。
湿法： 先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填 入柱子中，然后再加压用淋洗剂 “走柱 子”，本法最大的优点是一般柱子装的比 较结实，没有气泡。
上样
干法： 把待分离的样品用少量溶剂溶解后， 在加入少量硅胶（一般是样品的1~2倍量）， 拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小 心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但 可以保证样品层很平整。 而且适用于溶解性差的样品，使用湿 法则需要较多的溶剂，导致上样层变厚
柱层析技术的讨论
1.基本原理及分类 2.常用吸附剂 3.流动相体系 4.层析柱的选择 5.基本操作和注意事项
基本原理
色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在 两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同 来进行分离的。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与 固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随 着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次 的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不 同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适 当的检测方法结合，实现混合物中各组分的分离 与检测。
流动相体系的选择
特殊样品：会造成拖尾，严重影响分离效果 碱性物质
先用千分之一到百分之一的氨水、三乙胺或者氨甲醇， 碱化柱子
酸性物质
洗脱剂中加千分之一的醋酸，或苯磺酸
层析柱的选择
关于柱子的尺寸，应该是粗长 的最好 ：横截面/高度比 根据待分离的样品的量进行选 择：装柱太短了可能分离效果不
好，太长了也会由于扩散或拖尾导 致分离效果不好，同时浪费时间， 不稳定的物质还可能会变质。
流动相体系的选择
1.
首先从待分离物质的结构上判断
极性基团较多的，如胺基、羧基，选择极性 较大的体系。一般为甲醇：氯仿体系 可形成氢键部位较多的，应选择极性较大的 流动相体系 脂溶性集团较多的，一般乙酸乙酯：石油醚 体系就可以
2.
3.
流动相体系的选择
可替换的流动相体系 考虑到物质的溶解性和极性变化，上述 流动相体系还可以做一些变化：
吸附剂的选择
吸附剂的量的选择 一般为5~40倍 常用的为10~20倍 由流动相体系、吸附剂目数综合决定。
流动相体系
正己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二 硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯 <丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统（有时样品溶 解性差的可以加入二氯甲烷） 极性较大的用 甲醇：氯仿系统 极性大的用 甲醇：水：正丁醇：醋酸系统
塔板理论
基于热力学的塔板理论 它是色谱学的基础理论，塔板理 论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离 组分在分馏塔的塔板间移动，在每一 个塔板内组分分子在固定相和流动相 之间形成平衡，随着流动相的流动， 组分分子不断从一个塔板移动到下一 个塔板，并不断形成新的平衡。一个 色谱柱的塔板数越多，则其分离效果 就越好。
流动相体系的选择
由TLC实验数据推断柱层析流动相配比：
在选择一定的流动相的前提下，调整流动相组分或比例，使目标 物的Rf值为0.5，与邻近杂质的分离度至少在0.1以上（当然是越大 越好，Rf达到0.2~0.3就很容易分离了）
根据所选的吸附剂的目数
因为TLC是高效板，硅胶柱的分离效果较差，所以一般需要在 TLC流动相的基础上放大5~10倍，甚至更多才可以得到相似的分离 度
分附剂，洗脱剂（流动相）； 分配色谱柱（萃取原理）：载体，固定相， 流动相； 离子交换树脂柱； 凝胶柱
吸附色谱柱较为常用，下面重点讨论
吸附剂
硅胶 中性、酸性，比较适合分离中性或酸性物质 粒度100~200目，200~300目，300~400目，更 高 氧化铝 酸性，适合分离酸性物质 中性，pH值7.5，适合分离碱性物质 碱性，pH值10，适合分离碱性物质 聚酰胺 硅藻土 活性炭