westernblot原理及步骤
Western-Blot基本原理、过程及注意事项
Western Blot基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。
样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种，RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。
2、裂解液的成分，3、样品缓冲液sample buffer备注：1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。
一般不用超声，因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1：1混匀。
4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋白。
配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
4、分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：5、浓缩胶配方：6ml为例备注：1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。
2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。
5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。
胶固定后用滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。
它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。
一、原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。
最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。
二、步骤。
1. 样品制备。
将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。
然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。
2. 凝胶电泳。
将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。
根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。
3. 转膜。
将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。
4. 封闭。
将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。
5. 抗体孵育。
将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。
6. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育。
将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。
8. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。
9. 检测。
通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。
总结。
Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。
掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
蛋白免疫印迹法Westernblot原理及步骤
SDS-PAGE原理
SDS-PAGE ：是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理 液,SDS是1种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢 键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构. 强还原剂巯基乙醇等可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构.使蛋白质分 子被解聚成肽链形成单链分子.解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电 荷的蛋白质-SDS复合物 蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超过了它原有的净电 荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异.蛋白质的电泳迁移 率主要决定于亚基的相对分子质量,而与其所带电荷的性质无关.
❖ 2,电泳
向电解槽中加入适量的Running Buffer,将蛋白样品以50ug的标准 换算出的体积进行上样.以电压120V或160V进行电泳,电泳至前沿跑至 最底端即可进行转膜.
转膜
用硝酸纤维素膜NC膜,进行转膜.组装转膜三明治的过程在 Transfer buffer中进行：黑的1面在下,依次放上滤纸、凝胶、NC膜、滤 纸,然后合上三明治.整个过程必须保证无气泡.接着把转膜三明治放入转 膜槽中,注意正负极放置正确.倒入适量的Transfer buffer.在冰浴中进行 转膜.转膜条件：120V,1.5h或者150V,1h
ห้องสมุดไป่ตู้ SDS-PAGE:
❖ 1,灌胶：
❖ 1保证玻璃板干燥洁净,玻璃板对齐后放入夹中卡紧,垂直卡在架子上 准备灌胶.
❖ 2配好分离胶,加入TEMED,混匀后即可灌胶.灌胶过程中胶要沿着玻 璃板流下,防止有气泡产生.将胶灌至接近绿带中线即可.
❖ 3用去离子水进行液封,胶凝速度会更快加水时速度要慢,防止胶被冲 变形
匀.于冰上裂解20min.
❖ 3,14000r,10min离心.上清液即为所需蛋白样品液. ❖ 4,用Bradford蛋白分析法测蛋白浓度. ❖ 5,按100ul裂解液加30ul的6X的loading buffer 的比例,向蛋白样品液中填
westernblot原理及步骤
免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot技术：一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤一、配胶原理：30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细）10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。
与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。
同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。
每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上）2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml）10%方案如下：H2O 4.0ml30% acrylamide mix 3.3ml1.5M Tris(ph 8.8)2.5ml10% SDS 0.1ml10% ammonium persulfate 0.1mlTEMED 0.004ml3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。
不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了）4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满5、等待20分钟6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml30% acrylamide mix 0.67ml1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml10% SDS 0.04ml10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，等待20min二、测定蛋白浓度原理：A液是质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液（20ul protein assayS+1ml protein assay A），B液是质量浓度为0.01g/mL硫酸铜溶液。
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Western Blot的原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
1.收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分）维持4℃。
加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟。
移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟。
上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。
【具体方法】2.电泳（Electrophoresis）（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，【配制方法根据分离的目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度】（2）样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
（3）上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
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westernblot原理及步骤
1.western blot
即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2.原理
简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息
3.步骤
（一）蛋白样品制备
培养的细胞（定性）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。
3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在
5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。
若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反
6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
7.待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4.12000g离心，4℃，2min。
5.取少量上清进行定量。
6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
（二）SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板
（2）灌胶与上样
（3）电泳
（三）转膜
（四）免疫反应
（五）化学发光，显影，定影
（六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。