孕妇外周血中胎儿有核红细胞在非损伤性产前诊断中的研究进展

孕妇外周血中胎儿有核红细胞在非损伤性产前诊断中的研究进展
随着生活水平及生活质量的提高，遗传咨询中要求做产前诊断者越来越多。

目前，对遗传性疾病的产前诊断有数种方法。

常规使用有：羊膜腔穿刺、绒毛细胞吸取术、胎儿脐带血穿刺等。

这些方法诊断的准确性很高，但均属有创性操作，对孕妇和胎儿均有一定的风险，故主要用在怀疑孕育有染色体异常胎儿和高龄孕妇中。

而无创操作就超声波而言，只能发现明显畸形且发现时间通常较晚，对孕妇及胎儿来说均是残酷的打击。

而从孕妇外周血中获取胎儿细胞为非损伤性产前诊断开辟了一条颇具前景的道路，其中胎儿有核红细胞(NRBC)被公认为是可用于无创性产前诊断比较好的胎儿遗传物质来源。

1 孕妇外周血中胎儿细胞类型及其用于产前诊断的可能性
1.1 滋养叶细胞：其来源于胎盘滋养层，是最早出现于母血中的胎儿细胞与子宫的关系最为紧密。

与母血相比，滋养层细胞有独特的形态学特征，可以肯定地认为，母血中找到的滋养层细胞必定来自胎儿组织，理论上讲应是实施产前诊断的最佳侯选细胞。

但在早孕母血中含量极少且迅速陷于肺组织中，更使其在孕妇周围血含量更微，另外至今还不能找到一种特异性的抗滋养层细胞抗体，再加上滋养层细胞的多核性和胎盘镶嵌现象，导致其所含染色体并非总是与胎儿相符，更影响了诊断的准确性，所以滋养叶细胞不是理想的产前诊断细胞。

1.2 淋巴细胞：于14孕周出现于母体血液循环中，产后可持续存在于母体中1～5年或更长，较长滞留时间可影响下一次妊娠的产前诊断。

而且胎儿与母体的淋巴细胞表面无本质差别，通常的分离方法不能将二者分离，因而其在产前诊断的实际应用中受到限制。

1.3 胎儿粒细胞：1992年Weissman等[1]用亲合素标记的Y染色体特异性探针PY431进行非放射性同位素原位杂交，发现早在7孕周时母体与胎儿之间就存在着粒细胞的转移，认为可通过母血中的胎儿粒细胞进行性别诊断。

但目前有关胎儿粒细胞在产前诊断中的应用的研究较少。

1.4 胎儿NRBC：其被公认为是可用于非损伤性产前诊断比较好的胎儿遗传物质来源。

因有多种特征：（1）在胎儿血液循环中比例较高，故推测进入母体循环的数量也较多。

（2）有核红细胞在正常成人外周血中较罕见(一些临床上有出血的情况除外)。

（3）有核红细胞在孕妇血液循环中寿命很短，它的存在仅反应本次妊娠胎儿的情况。

（4）有核红细胞表面抗原相对稳定，易于识别。

（5）胎儿有核红细胞具有胎儿全部的基因组DNA。

2 孕妇血中胎儿NRBC的分离方法
在孕妇外周血中，胎儿NRBC数量甚微，与孕妇血中有核细胞之比为1∶1×107～1∶1×109。

怎样将如此微量的胎儿NRBC有效分离出来进行产前诊断分析是研究者不可回避的重要问题。

目前，分离胎儿NRBC有多种手段，主要包括密度梯度离心(density gradient centrifuge)、流式细胞技术（flow cytometry）、荧光激活细胞分类(FACS)、磁性激活细胞分类(MACS)、选择性细胞培养技术及显微操作分离法[2]。

2.1 密度梯度离心法：利用母血细胞与胎儿NRBC的理化性质间的差异，根据细胞密度的差异分离孕妇外周血中NRBC，分离介质为聚蔗糖～泛影葡胺。

根据形成梯度的不同可分为以下几种：三重密度梯度离心法能把血细胞分为4层，其中第二层细胞中主要含有有核红细胞，但胎儿NRBC所占比例较小；双重密度梯度离心法简化了操作步骤，宋杰等[3]利用此法分离胎儿NRBC并进一步用PCR方法检测胎儿性别，准确率达90.63％。

近年来，众多学者开始采用不连续密度梯度离心法(分离介质为Pereol1)对新鲜孕妇外周血离心，有核细胞层位于1.075～1.085 g/ml，这种操作方法简便，适合推广到临床，但该层中仍有大量的母源细胞，故而研究者们一般以密度梯度离心为基础，进一步结合其他方法进行分离纯化胎儿NRBC。

2.2 荧光激活细胞分选法( fluorescence - activated cell sorting，FACS)又称流式细胞技术：原理是通过流式细胞仪测定流动着的细胞悬液中单个细胞所发出的散射光和荧光等多种参数，然后通过细胞分选器将特定的细胞从整个细胞群体中分离出来。

这种方法的富集纯度高，但价格昂贵，操作步骤较复杂，可导致细胞的丢失，影响细胞的形态，而且以细胞的抗原抗体反应为基础进行分选，增加了母体非特异性结合的可能。

2.3 磁激活细胞分选法(magnetically-activated cell sorting，MACS)：其原理为用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞，在外加磁场的作用下，磁激活细胞分选器可将样品中与不带磁的细胞分开，以达到分离纯化的目的。

依据细胞表面抗原不同，磁激活细胞分选法可分为两种：阳性选择，直接根据NRBC表面或胞内特异性抗原的单抗分离之，此种方法很少单独使用；阴性选择，通过标记NRBC 以外的抗原，从而分离出污染的或需去除的细胞，留下所需要的纯化细胞。

2.4 电荷流分离法(charge flow separation，CFS)：这是近年来发展起来的一种较新的方法，它可以区分不同的细胞类型。

其基本原理为利用细胞表面的电荷不同，在电场力的作用下有不同的迁移速度而达到分离细胞的目的。

此法优点：分离迅速，被分离的细胞有活性，分离过程不需要抗体，但通过CFS分离的NRBC 30%是胎儿的，因此欲得到纯的胎儿细胞，还需与其他方法合用。

2.5 选择性细胞培养技术及显微操作分离法：近年用细胞培养法、显微操作分离法分离胎儿细胞也都有所报道，但这些方法因其分离效率低或操作复杂等因素难以推广运用。

3 胎儿NRBC在产前诊断中的应用
从孕妇外周血中富集胎儿细胞用于产前诊断目前尚属初步阶段。

现已从基因和染色体水平对孕妇外周血胎儿细胞作产前诊断。

在基因水平只要用PCR鉴别胎儿性别，研究地中海贫血病，研究Rh血型和HLA 多态性。

在染色体水平主要用荧光原位杂交(FISH)诊断21三体、18三体、Klinefelter 综合征和47，XXY 等染色体病。

3.1 基因水平上的遗传分析：单基因遗传病的诊断主要用PCR 方法。

目前应用最多是在基因水平上用PCR技术研究胎儿RH血型、杜氏肌营养不良、HLA 多态性以及β-地中海贫血等。

国内众多学者从母血中分离FNRBC，用PCR方法进行性别检测、杜氏肌营养不良的基因诊断。

王陶然等[4]从273例母血标本中分离胎儿NRBC，并应用引物延伸预扩增(primer extension preamp lification，PEP)和PCR方法检测巨细胞病毒( humancytomegalovirus，HCMV)的基因片段，以建立这种新的无创性产前诊断巨细胞病毒宫内感染的方法。

结果表明该方法的敏感性为95.12%，特异性为100%，符合率为99.27%，是较为理想的诊断方法。

3.2 染色体水平上的遗传学分析：用Ficoll密度梯度离心法富集胎儿NRBC，然后用13染色体探针进行杂交分析，发现有48%NRBCs显示出3个13染色体的杂交信号。

国内学者用13、18、21、X、Y染色体探针，已可对胎儿非整倍体染色体病进行产前诊断，且准确率较高。