酸菜中优良乳酸菌株的筛选
东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性研究
东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性研究目录一、内容概述 (2)1. 研究背景与意义 (2)2. 国内外研究现状 (3)3. 研究内容与方法 (4)二、材料与方法 (6)1. 材料选取 (6)东北传统酱腌菜样品采集 (7)耐盐乳酸菌分离纯化 (8)2. 实验室培养条件 (9)培养基选择与制备 (10)培养方法与步骤 (11)3. 耐盐乳酸菌筛选 (12)斜面初筛 (13)耐盐性测试 (14)4. 耐盐乳酸菌鉴定 (15)16S rDNA序列分析 (16)准备好凝胶电泳 (17)5. 发酵特性研究 (18)发酵条件优化 (19)产物分析 (20)三、结果与讨论 (21)1. 耐盐乳酸菌的筛选结果 (22)不同样品中的耐盐乳酸菌数量对比 (23)耐盐乳酸菌的生理生化特征 (24)2. 耐盐乳酸菌鉴定结果 (25)16S rDNA序列比对与分析 (26)准备好凝胶电泳图谱 (27)3. 发酵特性分析 (28)四、结论与展望 (29)1. 研究结论 (30)2. 研究创新点 (31)3. 研究不足与展望 (32)一、内容概述本研究聚焦于东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性，旨在深入挖掘和利用这一宝贵资源。
在筛选阶段，我们采集了多种东北传统酱腌菜样品，并经过严格筛选，成功分离出多株具有耐盐特性的乳酸菌。
这些乳酸菌在高盐环境中仍能保持旺盛的生长势头，显示出出色的耐盐能力。
我们运用先进的生理生化鉴定方法和分子生物学技术对这些乳酸菌进行了鉴定。
通过对比分析，确定这些菌株的分类地位及遗传特性，为东北传统酱腌菜的发酵剂提供科学依据。
在探究其发酵特性的过程中，我们对这些乳酸菌的生长曲线、产酸能力、耐盐能力等关键指标进行了系统研究。
这些研究结果不仅揭示了乳酸菌在酱腌菜发酵过程中的重要作用，还为其在工业生产中的应用提供了理论支持。
本研究不仅全面了解了东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的种类和特性，还为优化酱腌菜生产工艺、提升产品质量提供了新的思路和方向。
传统东北酸菜中优良发酵性能乳酸菌的筛选及应用
传统东北酸菜中优良发酵性能乳酸菌的筛选及应用赵山山S杜秋玲S杨晓艳S张莎莎S王磊S邸一桓S郝光飞S赵国忠2,周玉岩3*(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸056000;2.天津科技大学食品工程与生物技术学院教育部食品营养与安全重点实验室，天津300457;3.河北省药品检验研究院，河北石家庄050011)摘要:以传统东北酸菜为研究对象，从中分离筛选高产酸乳酸菌，通过探究乳酸菌的低温生长性能、耐盐特性及抑菌能力，从中获 得优良发酵性能的乳酸菌，其经分子生物学鉴定后应用于发酵酸菜。
结果表明，从传统东北酸菜分离筛选获得192株乳酸菌，其中5株 为高产酸乳酸菌，均被鉴定为植物乳杆菌CLactobaci/ius piantarum) ； 5株高产酸乳酸菌中植物乳杆菌D BC3和D BC33兼有多种优良性能，且在15 T；条件下，接种量为3%的植物乳杆菌D BC33发酵得到的酸菜感官评分最高，显著缩短了发酵周期(P<0.05)，为东北酸菜的标准化生产和酸菜发酵剂的制备提供了参考依据。
关键词:东北酸菜;高产酸乳酸菌;发酵性能;筛选;应用中图分类号:TS201.3 文章编号:0254-5071 (2019)01-0042-07 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.01.009引文格式:赵山山，杜秋玲，杨晓艳，等.传统东北酸菜中优良发酵性能乳酸菌的筛选及应用J].中国酿造，2019,38(1):42-48.Screening and application of l actic acid bacteria with superior fermentation performance fromtraditional pickle in the northeast of ChinaZ H A O Shanshan1, D U Q iu lin g1, Y A N G X iaoyan1, Z H A N G Shasha1, W A N G L e i1, D I Y ih u a n1, H A O G uangfei1,Z H A O Guozhong2, Z H O U Y uyan3*(l.C ollege o f L ife Science and Food Engineering，Hebei University o f E ngineering，Handan 056000, China; 2.K ey L aboratory o f F ood Nutrition and Safety, M inistry o f E ducation，College o f F ood Engineering and Biotechnology，Tianjin University o f S cience & Technology，Tianjin 300457, Chi^a; 3.Hebei Provincial Institute for Drug Control, Shijiazhuang 050011, China)Abstracts Using traditional pickle in the northeast o f China as research object, the high-yield acid lactic acid bacteria were isolated and screened. The lactic acid bacteria w ith superior fermentation performance were obtained by exploring the lo w temperature growth performance, salt tolerance and antibacterial ability, identified by molecular biology and applied in the fermented pickle. The results showed that 192 lactic acid bacteria were obtained from traditional pickle in the northeast o f China, among them, 5 strains were high-yield acid lactic acid bacteria, w hich were identified as Lactobacillus plantarum，and the L. plantaium DBC3 and DBC33 had a variety o f superior fermentation properties. The sensory evaluation o f the fermented pickle by L. plantaium DBC33 w ith inoculum 3% at 15 ^was the highest, and the strain DBC33 significantly shortened the fermentation period o f pickle (P<0.05). This study provided a reference basis for the standardized production o f p ickle in the northeast o f China and preparation o f pickle starter. Key words ： pickle in the northeast o f China; high-yield acid lactic acid bacteria; fermentation property; screening; application酸菜是在一定浓度的盐溶液中经微生物作用泡制而 成的蔬菜食品[1]。
东北酸菜发酵中几株乳酸菌的筛选
（ ａｙ ａ ｏｍ ｌＵ ｉ 。Ｓ ａ ｘ ３ ０ １ Ｔ ｉｕ ｎ Ｎ ｒ ａ ｎ． ｈ ｎ ｉ ０ ３ ） ０
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔ ｒｅ ｓ ａｎ ｒ ｃｅ ｎ ｄ ｉｔｎｉｎ ｌ ｔｒｉｇｆｏ ａ ｅｋａ ｔ ｕｃ ｏｌｃｅ ｒｍ ＮＥ Ｃ ｉａ ｔｗ ｓ ｓｒ ｃ ｈｅ ｔ ｉｓｗｅｅ ｓｒｅ ｅ ｎｅ ｔ ａｌ ｓ ｔ ｒｍ ｓｕ ｒｒｕ ｉｅｃ ｌ ｔｄ ｆ ｈｎ ．Ｉ ａ ｒ ｏ ｙ ａ ｎ ｊ ｅ ｏ
酸菜菌种筛选用培养基
酸菜优良发酵菌种的筛选及应用研究中采用的培养基和方法1、乳酸菌分离固体培养基蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，吐温80 0.05%，番茄汁20%，CACO32g，溴甲酚绿0.01%，琼脂2g。
调PH值6.5，121度，灭菌15min。
2、MRS培养基蛋白陈10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4..4H2O 0.25g，蒸馏水1L。
调PH值6.2-6.4，121灭菌15min。
（固体培养基1L培养基加15g琼脂）。
3、用于肠膜明串珠菌的选择性培养基植物蛋白胨20g，肉浸膏10g，酵母提取物6g，柠檬酸铵5g，葡萄糖10g(分别灭菌)，吐温80 0.5g，MgSO4.7H2O 0.2g，MnSO4..4H2O 0.05g，FeSO4. 7H2O 0.04g，四环素0.12ug/ml蒸馏水1L 调PH值6.2-6.4，121灭菌15min。
4、M17培养基植质蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，1.0mol/L MgSO4.7H2O 1ml，一甘油磷酸二钠19g，琼脂15g，蒸馏水1L。
PH值7.15、PY基础培养基蛋白胨0.5g，胰酶解酪（Trypticase）0.5g ，酵母提取物1g，盐溶液4g，蒸馏100ml水盐溶液成分：无水CaCl20.2g，MgSO4.7H2O 0.48g，K2HPO41.0g，KH2PO4 1g，NaHCO3 10g，NaCl 2.0g。
将CaCl2和MgSO4.7H2O混合溶于300ml蒸馏水中，再加500ml 水，边搅拌边加入其他盐类。
继续搅拌直至全部溶解，加200ml蒸馏水，混合后贮备于4℃备用。
6、PYG琼脂培养基在PY基础培养液内加入1g葡萄糖即成为PYG培养基。
另在上述培养基中加入0.1%刃天青液0.1ml和半肮氨酸一HCL.H2O 0.05g，并在厌氧条件下制作培养基。
酸菜中乳酸菌的筛选与初步鉴定
３２革 兰 氏染 色 ．
蛋 白胨水培 养基 ：蛋 白胨 １ｇ ０ ，氯化钠 ５ ，蒸 ｇ
馏水 １０ ｍｌ Ｈ ．～７４ ２ ℃ 湿 热灭 菌２ ｍｉ． ０ ０ ，ｐ ７２ ．．１ １ ０ ｎ
革 兰 氏染 色后 ，镜检 结果表 明 ：所选取 的 六 个
菌株 中Ｃ 号 为 阴性 ，其余 均 为革 兰氏 阳性 （图２）． ６ Ａ１ ２ ３ 、Ａ 、Ｂ 、Ｂ４ 、Ｃ５ 菌株都 呈 紫 色 ，即革 兰氏 染
等酸 菜企业 采 用现代 化 工 厂进 行 大规 模 生 产 ， 占据 工 业化 生产 奠定基 础 ．
了国际酸 菜 市场９ ％ｖ上 的份 额 ． ５ Ｙ ， 近年 来 ，在我 国部
基 金 项 目：玉 林 师 范 学院 高层 次人 才 科 研启 动 基 金
（ ２ ０ ０ ２． Ｇ ０９ ４ ）
利 于工 厂化 、规 模 化及 标 准化 生 产 ， 而且 容 易产 生 进 、 实现 产业 化 具有 重要 的 意 义． 研 究从 酸 菜 中 本
对人 体 有 害的 亚硝 酸 盐【 相 比之 下 ，韩 国 、 日本 筛选鉴 定 乳酸 茵 ，为开发 酸 菜的优 良发 酵剂 与现代 １ ・ ．
喜 爱． 菜汁 中富含 活性 乳 酸 茵 ，赋 予 酸 菜 多种 营 物 ，乳 酸菌的发 酵性能 直接影 响酸 菜的品质，采用纯 酸 ， ． 养保 健 功 效 ． 国的酸 菜制作 大 多沿 袭传 统 的 自然 种乳 酸 菌发酵 可 降低 发 酵蔬 菜中的亚硝 酸盐含 量ｐ 我
发 酵 工 艺 ，规 模 小 ，产量低 ，发 酵质 量 不稳 定 ，不 因此 ，深入 研 究酸 菜 中的乳 酸 茵 ，对 酸 菜质量 的 改
自然发酵酸菜汁中乳酸菌的分离、鉴定+及发酵剂的筛选
第４期
毕金峰等：自然发酵酸菜汁中乳酸茵的分茵、鉴定及发酵剂的筛选
－３４７
培养基为Ｉ号培养基（用于乳酸菌分离、活化）、Ⅱ号培养基（用于乳酸菌计数）、Ⅲ号培养基（用于乳酸
菌鉴定）。
１．２试验方法
１．２．１ 自然发酵酸菜汁中乳酸茵的分离、筛选的试验程序自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑
2007(10)
11.巨晓英.韩烨.周志江 自然发酵泡菜中乳酸菌的分离鉴定[期刊论文]-食品与机械 2008(5) 12.陈仲翔.董英 泡菜工业化生产的研究进展[期刊论文]-食品科技 2004(4) 13.曾凡坤.侯东军 提高青菜头泡菜品质初探[期刊论文]-食品与发酵科技 2011(6) 14.张茜.赵文婧.李嘉祺.段学强 山西高平市农家酸菜汁中乳酸菌的分离及鉴定[期刊论文]-微生物学杂志 2010(4) 15.卢晓黎.尼海峰 发酵蔬菜功能菌研究与应用进展[期刊论文]-中国食品学报 2012(2)
图４不同ｐＨ值培养基按种Ｌ一乳
ｎ羽ｇｒｎｏ砷４酸ｔ恤球０ｆｅ一Ｌｆ—董 ｆｅ种ｌｃ删ｔ生ｓｃ长删０情ｆ Ｃ况ｐＯｌＣＩＣ∞ ＵＳｔｋ ｎ硼唧 Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｃａｌｔｍｔ
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３
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５
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２．２发酵剂初选试验结果分析 从表３可以看出：接种发酵速度均明显快于对照，随时间延长，ｐＨ值初期下降快，后期下降慢，可滴
酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选
酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选酸菜是一种以青菜为原料，经过盐腌、发酵而成的食品，具有浓郁的口感和酸爽的味道，深受人们喜爱。
而在酸菜的发酵过程中，乳酸菌是一种非常重要的菌种，它不仅有利于酸菜的发酵和保存，还对人体健康有益，因此在酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选成为了一个重要的研究课题。
一、乳酸菌对酸菜的重要性乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，主要包括嗜酸乳杆菌、乳酸杆菌等多种，它们具有优良的发酵能力，能够将蔬菜中的糖类发酵成乳酸，从而降低pH值，产生特有的酸味。
在酸菜的发酵过程中，乳酸菌不仅能够提高食品的风味和营养，还能够抑制有害菌的生长，达到保鲜和防腐的作用，因此它是酸菜发酵中不可或缺的菌种。
二、乳酸菌的检测方法乳酸菌的检测方法主要包括传统的培养法和分子生物学方法两种。
1.培养法培养法是最为常见和传统的乳酸菌检测方法。
首先是样品的处理，将酸菜样品加入生理盐水中进行搅拌，再进行一定的稀释，将样品接种在适宜的培养基上，通过一定的温度和时间进行培养。
最后通过肉眼观察和显微镜检查菌落的数量和形态特征，来判断样品中乳酸菌的含量和种类。
2.分子生物学方法分子生物学方法是近年来发展起来的一种新型检测方法，其主要包括PCR技术、实时荧光定量PCR技术和基因测序技术。
这些方法通过检测样品中特定的乳酸菌基因序列，来确定其种类和含量，具有准确、灵敏、高通量等优点。
三、乳酸菌的筛选方法酸菜的发酵中选择适宜的乳酸菌菌种至关重要，而乳酸菌的筛选主要包括筛选菌株、筛选菌种、筛选发酵工艺三个方面。
1.筛选菌株筛选菌株是乳酸菌筛选的第一步，通常可以通过对多种来源的酸菜样品进行采样和分离，然后在适宜的培养条件下进行发酵，并观察其酸度、口感、保存性等指标，最终选出具有较好特性的菌株。
2.筛选菌种在确定了优良的菌株后，还需要通过分子生物学手段对其进行鉴定和分类，进而确定其属于哪种菌种，这有助于更好地掌握和利用其生物特性。
3.筛选发酵工艺在确定了优秀的乳酸菌菌种后，还需要对其进行发酵工艺的优化和选择，包括发酵温度、发酵时间、发酵pH值等因素，以期使其发挥出最佳的发酵效果。
自然发酵酸菜汁中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究
参考文献：
（Ｉ】１
金世琳．乳品工业手册【Ｍ】．轻工业出版社，１９８７．
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品机械，２００３，２１（３）：２７．２８．
【３】３
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２．２．１ 纸层析乳酸定性结果 采用乳酸定性分析，通过纸层析法对乳酸标准溶液
和Ｌ，７、Ｌ．８和Ｌ一６三菌株的各Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ号发酵液进 行对比试验，试验结果见表２。
表２结果表明，Ｌ．７、Ｌ一８和Ｌ．６的发酵液中均含有
表２ 发酵液Ｒｆ值测定结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｆ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｊｕｉｃｅ
本研究旨在对传统自然发酵的酸菜进行乳酸菌的分离
鉴定，为酸菜的纯菌发酵和现代工业化生产奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂
１．１．１
材料
大白菜 吉林农业大学农贸市场；食盐
业公司。
长春市盐
１．１．２ 主要试剂及仪器 蛋白胨、酵母提取物、吐温８０、牛肉膏、琼脂：
收稿日期：２００５．０４—２７ 作者简介：陈晓平（１ ９６３一），男，教授，博士，研究方向为功能食品。
２ 结果与分析
２．１ 乳酸菌的分离筛选结果 经分离筛选，得Ｌ．１、Ｌ一２、Ｌ．３、Ｌ．４、Ｌ一５、Ｌ一
６、Ｌ一７、Ｌ．８、Ｌ一９菌株。 结果见表１。
Ｔａｂｌｅ １
表１ 乳酸菌的分离与优选结果 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
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酸菜中优良乳酸菌株的筛选
微生态发酵食品是一种绿色环保食品，专门用于食品发酵的一类微生物添加剂，由乳酸菌、酶和一些营养物组成，主要作用是有目的地调节食品内微生物区系，调控发酵过程，促进乳酸菌大量繁殖、更快地产生乳酸，促进多糖与粗纤维的转化，从而有效地提高食品的质量，所以具有足够数量和活力且保证较长货架寿命的发酵剂的生产和供应成为先决条件。
1 主要仪器及实验材料
1.1 实验培养基
（1）液体MRS培养基：酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80g/L，乙酸钠5g/L，牛肉粉10g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，蛋白胨10g/L，蒸馏水配制，pH 6.2～6.6。
（2）CaCO3MRS固体培养基：在MRS液体培养基基础上加
0.5%的CaCO3。
1.2 主要仪器
78HW-1恒温磁力搅拌器，杭州仪表电厂；SY-2-4电热式恒温水浴锅，天津市欧诺仪器仪表有限公司；DT5-1低速离心机，北京时代北利离心机有限公司；78-1磁力加热搅拌器，上海南汇电讯器材厂；LDZX 50KB高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ALC-2100电子天平，上海精密仪器仪表有限公司。
1.3 常用溶液生理盐水
NaCl：8.5g/L；盐酸：4%。
1.4 实验材料
市售酸菜。
2 实验方法
2.1 菌株的筛选及分离
100mL三角瓶装30mL生理盐水，灭菌后待用。
4℃冰箱中取出
贮存样品，取3mL装于装有30ml蒸馏水的三角瓶中，然后摇床振荡10min，再静置5min，即成10-1稀释度的样品溶液。
按照梯度稀释法制备10-3的稀释溶液。
取每个梯度的稀释溶液各200μL，涂于含有CaCO3的MRS固体培养基平板上，于37℃恒温箱培养。
菌落出现后，根据菌落形态的差异挑取菌落，然后接种于液体培养基中，37℃振荡培养，并将培养基贴纸记号为S1、S2、S3。
再进行梯度稀释，最后通过菌落划线等方法，最终获得单一纯化的菌株，保藏。
2.2 菌株鉴定
（1）将筛选到的乳酸菌株划线接种于含有CaCO3的MRS培养基中，37℃恒温培养，然后考核菌落的形态。
（2）基因组DNA的提取：取37℃恒温培养2d的菌液，10，000 rpm离心10min，取沉淀，沉淀为菌体。
将制备的菌体加入500μL溶菌酶液，37℃保温1h，1h 后补加溶菌酶液100μL，再45℃作用30min，直至透明。
将制得得透明溶液加10%的SDS，使浓度达到2%，去除杂蛋白，13，000 rpm离心10min。
取上清液，再分别用等体积酚、酚：氯仿、氯仿依次进行抽提。
上层溶液加等体积异丙醇沉淀10min，再13，000rpm离心15min。
沉淀用30μL无菌水溶解，备用。
（1）扩增与分析选用引物p7F和1492R，以分离菌株的基因组DNA为模板，以便扩增。
程序设定为95℃为5min，94℃为1min，50℃为1min，72℃为1min，30个循环后72℃延伸10min。
扩增产物回收纯化，进行序列测定。
所测得的序列与基因库中的16SrDNA进行Blast分析。
3 结果
3.1 乳酸菌的筛选分离
经过稀释涂平板、形态观察和16SrDNA检测等步骤，从企业提供的样品中分离得到3种菌株。
经比较分析，确定S3为乳酸菌，如图1所示，S1为屎肠球菌（E.faecium）、S2为粪肠球菌（E.faecalis），对S3乳酸菌进一步深入研究。
3.2 菌株的鉴定
（1）菌落形态观察：经染色，S3为革兰氏阳性菌；生长良好，呈乳白色，表面光滑（图1）。
经观察，呈球状，如图2所示。
（2）16SrDNA保守序列分析：经扩增，扩增出1，500bp的16SrDNA片段。
扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒的纯化，连接到pEASY-T3载体上，选取阳性克隆测序。
经测序结果的序列进行拼接，得到16SrDNA序列。
经Blastn对比，得知所得序列与已报道的Lactobacillus菌株的16SrDNA有100%的一致性，确定其为Lactobacillus。
4 讨论
本研究将样品置于cMRS中，37℃选择性的增殖了乳酸菌，消除了其他菌体的干扰，通过基因组DNA抽提、16SrDNA保守序列分析及电泳，最终鉴定S3为Lactobacillus。