SILAC定量蛋白质组学技术简介
定量蛋白质组学研究技术
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四 针对性亲和标签技术
磷酸化蛋白质同位素标识亲和标签
➢ PHIAT技术是建立在ICAT技术基础上旳研 究和鉴定磷酸化蛋白质磷酸化位点旳新措施， 且对低丰度蛋白质旳鉴定有效。
➢ PHIAT试剂具有亲核旳巯基和同位素标签及 其共价结合旳生物素基团。
➢ 利用此措施已成功鉴定了酪蛋白和酵母提取 物旳磷酸化位点。
经 过 用 N-acetoxy-[2H3]-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS) 乙 酰 化 处 理酶解肽段，把同位素标签引入样本分 析体系中。NAS可标识必需氨基酸亲和 肽段旳N末端。因为肽段旳乙酰化位点 不一，被标识旳重链和轻链质量差也不 固定，给自动化分析带来了一定困难。
➢ 每一种试剂都涉及三部分：一种报告基 团（分子量分别为114u、115u、116u 和117u）、一种平衡基团（分子量分别 为31u、 30u、29u和28u）和一种与 肽段反应旳基团。
➢ 当我们需要同步比较四组不一样品时， 样品分别跟四种iTRAQ试剂结合，然后 混合在一起做质谱鉴定。
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♣ 可裂解同位素标识亲和标签
✓ 用13C/12C替代了2H/1H ✓ 使用了酸裂解连接子 ✓ 不同肽段质量相差9u或9u旳倍数 ✓ 亲和标签试剂由3部分构成
• 半胱氨酸特异性反应基团 • 含9个同位素13C或12C标签旳可裂解连接子 • 亲和纯化生物素
SILAC定量蛋白质组学
将SILAC技术应用于更多生物学问题研究中，如药物筛选、 疾病机制研究等。
智能化与自动化
开发基于人工智能和机器学习的SILAC数据分析方法和自动 化实验流程，提高实验效率和数据分析的智能化水平。
04
SILAC定量蛋白质组学研 究案例
案例一：肿瘤蛋白质组学研究
总结词
通过SILAC技术，对肿瘤细胞系进行蛋白质组学分析，发现与肿瘤发生、发展相关的关键蛋白质。
对分离后的蛋白质进行质谱分 析，比较标记和非标记蛋白质 的相对丰度。
细胞培养
将细胞培养在含有稳定同位素 标记的氨基酸的培养基中，使 细胞合成标记的蛋白质。
蛋白质分离
通过凝胶电泳或色谱技术将蛋 白质进行分离。
数据分析
对质谱数据进行处理和分析， 得出蛋白质的相对定量结果。
SILAC的优势与局限性
优势
SILAC技术具有高灵敏度、高准确性 和高重复性，适用于大规模蛋白质组 学研究，能够同时对多个蛋白质进行 定量分析。
互作验证
02
03
互作动力学
SILAC技术可以用于验证已知的 蛋白质相互作用，以及发现新的 相互作用。
此外，SILAC技术还可以用于研 究蛋白质相互作用的动态变化， 有助于深入了解细胞生理过程。
蛋白质修饰研究
修饰鉴定
利用SILAC技术可以鉴定出蛋白质的修饰，如磷酸化、糖 基化、乙酰化等。
01
修饰定量
详细描述
SILAC技术用于标记肿瘤细胞系中的蛋白质，通过比较正常细胞和肿瘤细胞的蛋白质表达谱，发现差 异表达的蛋白质，进而研究这些蛋白质在肿瘤发生、发展中的作用。
案例二：神经科学蛋白质组学研究
总结词
应用SILAC技术分析神经细胞蛋白质组， 揭示神经细胞功能和信号转导机制。
非靶向蛋白组学定量技术
非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT定量蛋白组学的研究意义人类基因组完整图谱于2003年正式公布，这标志着生命科学的里程碑性事件——人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究也进入了后基因组时代。
这一计划的初始目的是在基因层面研究人类疾病机制，设计基因药物，进行精准医疗。
但是时隔十多年年过去了，效果远没预期的理想。
其中主要原因可能是，我们现有的研究工作和背景知识不足以将庞杂的基因组数据直接同人类疾病联系起来。
而蛋白组学能更直观的将基因与疾病联系起来，逐渐成为研究热点之一。
定量蛋白组学是将某一基因组或者某一复杂体系表达的全部蛋白质进行鉴定和精准定量的学科，是蛋白组学研究的重要分支。
基于质谱的蛋白质定量20实际80年代中期出现了MALDI（基质辅助激光解吸附电离）和ESI（电喷雾电离）两种软电离方法，可以将蛋白质或者多肽离子化，从而引入质谱仪种进行定性和定量分析，从此生物质谱技术成为蛋白组学最重要的分析工具之一。
图1. 生物质谱仪器。
利用生物质谱技术，主要有两种蛋白组学研究策略：Top-down strategy：Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二维凝胶电泳分离蛋白，再将完整蛋白直接离子化后引入质谱分析，借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，从而实现对蛋白的鉴定。
Bottom-up strategy：Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先将样品用酶进行处理，多维色谱分离后引入质谱分析，再借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，最后实现对蛋白的鉴定。
蛋白定量分为相对定量和绝对定量，由于电泳技术具有重复性差等缺点，而多维色谱能将样品酶解物稳定分离，因此蛋白的绝对定量多采用自下而上的方法。
虽然绝对定量似乎更为理想，但是绝对定量更为复杂和昂贵，而相对定量在很多时候就能满足科研需求，因此，相对定量更为常用。
利于质谱技术，可根据特定质谱峰的信号强度来确定蛋白质含量，主要的方法又分为非靶向定量蛋白组学（标记定量和非标记定量）和靶向定量蛋白组学。
定量蛋白质组学的方法有哪些
定量蛋白质组学的方法有哪些？1 背景和意义从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病理研究）已成为研究生命科学的主要手段。
而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。
对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。
生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。
基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。
2 方法学介绍目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种，分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRM HR)、和SW ATH。
简述如下：2.1 Label-freeLabel-free定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、重复性要求较高，准确性也较标记定量差。
因此，Label-free技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。
2.2 iTRAQiTRAQ定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量准确，可同时对8个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。
silac定量蛋白质组学
silac定量蛋白质组学摘要：I.介绍- 蛋白质组学- silac 定量蛋白质组学技术II.silac 技术的基本原理- 稳定同位素标记- 细胞培养条件下的应用III.silac 技术的应用- 蛋白质定量- 蛋白质组差异分析IV.silac 技术的优缺点- 优点- 高精度- 高效率- 缺点- 成本较高- 技术复杂V.总结- silac 技术的意义- 展望未来正文：I.介绍蛋白质组学是研究细胞或组织中所有蛋白质组成、表达和功能的一门科学。
近年来，随着蛋白质组学技术的不断发展，越来越多的研究者开始关注于定量蛋白质组学。
其中，silac 定量蛋白质组学技术是一种广泛应用的方法。
II.silac 技术的基本原理Silac，全称为“稳定同位素标记氨基酸在细胞培养条件下的应用”，是一种基于稳定同位素标记技术的定量蛋白质组学分析方法。
在这种方法中，研究人员首先将细胞培养在含有稳定同位素标记氨基酸的培养基中。
这些标记氨基酸会参与到蛋白质的合成过程中，从而使得蛋白质中带有标记。
随后，研究人员通过质谱分析，对带有标记的蛋白质进行定量分析。
III.silac 技术的应用Silac 技术广泛应用于蛋白质定量、蛋白质组差异分析等领域。
通过这种技术，研究者可以在同一实验条件下，对不同样本中的蛋白质进行精确定量，从而揭示蛋白质表达的差异。
此外，silac 技术还可以应用于蛋白质翻译后修饰的研究，以及对蛋白质表达调控机制的探究。
IV.silac 技术的优缺点Silac 技术具有较高的精度和效率，可以在短时间内得到大量蛋白质的信息。
然而，这种技术的成本较高，且技术复杂，需要专门的设备和技术支持。
此外，silac 技术还存在一定的局限性，例如，某些特殊类型的蛋白质（如糖基化蛋白质）在silac 技术中难以定量。
V.总结总的来说，silac 技术为定量蛋白质组学提供了有力的工具。
SILAC
SILAC技术介绍及操作陈宁稳定同位素标记原理体内标记体外标记通过代谢标记、酶反应Array或化学反应，将重/轻同位素标签标记于不同样品的蛋白质或肽段，等量混合后通过色谱、SDS-PAGE的分离，然后进行质谱鉴定。
根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。
优点1）样本需求量少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量；2）采用质谱定量，定量结果准确且批次变异小、重复性好；3）体内代谢标记与SDS-PAGE或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白，不受蛋白性质限制；4）多个样品混合后同时进行分离、酶切和鉴定，后续实验对样品的影响是一致，减少了实验操作和仪器设备产生的影响；5）由于该技术属于体内标记，标记效果稳定，其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合于进行全细胞蛋白的分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量。
应用1) 多个样品全细胞蛋白或亚细胞蛋白的差异比较；如：前列腺癌微粒体蛋白的差异比较、HCV相关的细胞脂阀蛋白研究等2) 同一样品不同条件下全细胞蛋白或亚细胞蛋白的差异比较如：厚朴酚刺激前后的Hela细胞蛋白质变化、凋亡过程中细胞核蛋白变化等3) 将SILAC与IP技术相结合，可用于研究特定蛋白质的相互作用蛋白分析；4) 通过对质谱谱图的解读，还能进行磷酸化位点的确认和磷酸化蛋白的定量分析。
应用范围活体培养的细胞或低等有机体（如蠕虫），对于疾病研究中常用的组织样品、体液样品等无法分析SILAC操作参考1. SILAC-标记培养液的准备2. 标记效率的确定3. 标记培养4. 蛋白的分离与鉴定5. MSQuant软件分析差异蛋白1. SILAC-标记培养液的准备1.1 试剂（根据实验选择）•缺陷培养基：Lysine 缺陷型DMEM / RPMI-1640培养基、Arginine 缺陷型DMEM / RPMI-1640培养基、Methionine 缺陷型DMEM / RPMI-1640培养基; 氨基酸缺陷型DMEM/RPMI-1640培养基•“heavy AA”（标记型）：13C6-Arginine 、13C 615N 4-Arginine 、13C 6-Lysine 、13C 615N 4-Lysine 、methyl-13C 2H 3-Methionine 、D3-Leucine 等•“light AA”（非标记型）：L-Arginine ，L-Lysine ，L-Methionine 等•透析型血清1.2 细胞培养液的配制•在缺陷型培养液的基础上加入“heavy / light AA”，可根据细胞状态酌量添加透析型血清含量。
SILAC蛋白组
SILAC蛋白组
SILAC蛋白组或SILAC定量蛋白组学，是指利用SILAC技术对蛋白质组进行定量研究。
百泰派克生物科技提供基于SILAC标记的定量蛋白组分析服务。
SILAC
在基于质谱(MS)的定量蛋白质组学中，SILAC（Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture）是通过在细胞培养过程中加入稳定同位素标记的
氨基酸对样品进行标记后结合质谱检测，对样品进行蛋白质组学分析的方式是一种简单、可靠而又强大的方法。
SILAC通过正常代谢过程对细胞蛋白进行标记，在新
合成的蛋白质中加入非放射性的、稳定的含同位素的氨基酸。
SILAC提供了准确的
相对定量，不需要任何化学衍生或操作，即可实现蛋白质组学分析。
SILAC属于体
内标记技术，使样品更接近自然状态，其标记效率高达100%，且标记效果稳定，
适合于全细胞蛋白分析，以及膜蛋白的鉴定和定量，每个样本只需要几十微克的蛋白量。
SILAC蛋白组分析
SILAC定量蛋白组分析的实验流程是：在细胞培养基中加入轻、中或重型稳定同位
素标记的必需氨基酸赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)，在细胞生长过程中，新合成的蛋白质带上稳定同位素标签。
培养一段时间后，等量混合细胞培养物中各类型蛋白质，酶解后进行质谱分析。
由于质量差异，可以在质谱仪中区分带有不同稳定同位素组成的化学性质相同的肽对。
通过比较一级质谱图中不带标记和带同位素标记的质谱峰型的面积大小即可进行相对定量，同时二级谱图还可以对肽段进行序列测定从而进行蛋白鉴定。
SILAC蛋白组。
SILAC定量技术方案
SILAC定量技术方案——样品制备1. 细胞培养和蛋白提取（1）. MEM培养基的准备（配制400 mL ）①制备氨基酸储液：分别在20mL L-Arginine缺陷型MEM培养基中配置0.30mM（50% 正常浓度）的13C6 L-Arginine hydrochloride 和13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride 储存液（均称取26 mg）,待充分溶解后，分别用0.22pm的无菌滤器过滤。
②分别加入20mL除菌后的氨基酸储液、10%的透析胎牛血清、1%的青链霉素、2mM的L-Glutamine和2mM的丙酮酸钠并用缺陷型MEM培养基定容到400 mL,贮存于4°C。
每种完全培养基中的氨基酸浓度见表4-1:表4-1 MEM 培养基中轻、中、重L-Arginine的浓度（2）.细胞培养将A、B、C三种细胞复苏后，分别接种于10cm培养皿中，在常规RPMI 1640培养基（添加10%的透析胎牛血清和1%的青链霉素）中培养HL-7702，分别使用仅含有13C6 L-Arginine hydrochloride 禾口13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride 的MEM培养基培养B和C，经过5-6个细胞世代的培养后，将细胞数量扩增到107-108左右（5-6盘）。
（3）.蛋白提取用500卩全细胞裂解液（50 mM Tris，pH 7.4; 150mM NaCl ;1%Triton-100 ; 1mM AEBSF ; 20 卩1/ 卩g apro ；n20 p 1/ 卩g leupeptin)2. 蛋白质含量测定(1) . 采用改进的Bradford 法，将BSA 分别稀释为从0-1.40mg/ml 范围内若干浓度，待测样品稀释10 倍、20倍，各取20 丄加80 让0.12M HCl ，轻轻混匀。
(2) . 各管再加入3.5ml 过滤的稀释4 倍的dye reage nt 轻轻混匀，静置5min 后测A595 值。
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1.2.3：蛋白质分离与质谱分析
（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量 混合，SDS-PAGE分离，染色。 （2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。 （3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL™)分析，数据检索。
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1.2.1：培养基准备
材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基， Lys或（和）Arg缺陷 型DMEM培养基。 （2）：透析FBS。 （3）：稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), LLysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。
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SILAC定量蛋白质组学
1：SILAC定量蛋白质组学原理 2: 应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用
SILAC定量结果图例，质谱峰的高度表示蛋白表达的相对强度 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663
2.1 Quantification of phosphorylation by SILAC
Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio>1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosine phosphorylation level,and those with ratios<0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease
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SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg 的培养基中添加Lys和Arg的 同位素Lys(D4或13C6 15N4)、 Arg(13C6,或13C6 15N4)等培 养细胞，使蛋白质被标记成 “中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组 蛋白质、SDS-PAGE电泳、染 色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋 白酶消化，质谱分析。
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2.1：SILAC定量蛋白质组学实例
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2.1 Schematic for SILAC
SILAC实验流程图
2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed
2.3 SILAC研究蛋白质与DNA相互作用
Genome Res. 2009 19: 284-293
2.4 SILAC研究蛋白质与RNA相互作用
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1.2.2：细胞标记与测试
标记： 一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2 天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。 添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞 相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐 成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为 10KDa.
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1.2.4：结果形式
LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果 将会已EXCEL表格呈现。 肽段质谱峰图及表达量：
2: SILAC应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学实例 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用
1.1：SILAC定量蛋白质组学原理
技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法
（1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测 测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞 或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两 种氨基酸，操作方便。
细胞经过传代培养7天后，同一肽段被“重”型肽段取代
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1.2.3: 实验处理
当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行 细胞处理，如药物处理，病毒处理等。
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1：SILAC定量蛋白质组学原理
1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理 1.2：SILAC技术流程 1.2.1：培养基准备 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4：结果形式
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2.1 Conclusion
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2.2 SILAC研究蛋白质与蛋白质相互作用
J. Cell Biol. Vol. 183 No. 2 223–239，2008
培养基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培 养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过 滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重” 型培养基。
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标记测试： 在进行正式实验之前，需要对细胞进行标记测试，测试细胞中 蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取 蛋白质后，等量混合，SDS-PAGE分离，LC-MS/MS检测。
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1.2.2：细胞标记与测试