生物药物分离纯化与提取方式
生物活性物质的分离与纯化技术
生物活性物质的分离与纯化技术：从原理到应用生物活性物质的分离与纯化是生物学、生物工程以及药物化学等领域中非常重要的研究方向。
这种技术主要用于提取天然产物、发现新药物以及研究生物活性物质的信号转导机制等方面。
在对生物活性物质进行研究时，需要对其进行分离与纯化。
本文将从原理、方法及应用三个方面入手，介绍现代以及其应用。
原理：生物活性物质的分离与纯化是指将复杂的混合物中的有用成分索取出来，而该成分通常只是其中一小部分。
因此，分离和纯化的成果往往是非常少的，需要注意提高分离的效率和选择性。
生物活性物质通常是复杂多样的，并且在混合物中的浓度非常低。
因此，需要采用一系列的分离与纯化方法，才能使其荟萃反映出来。
生物活性物质的分离与纯化方法按照其物理、化学性质和分子的大小等因素进行分类。
常用的方法包括：离子交换、透析、层析、电泳等。
方法：离子交换是一种最常见的分离与纯化技术。
其基本原理是根据生物物质的电荷差异，在离子交换树脂上进行吸附和脱附。
离子交换树脂是一种将有机化合物固定在其中的高分子物质。
在离子交换分离过程中，生物物质溶液经过树脂的时候，离子交换树脂会对其带电的分子进行吸附，并将其吸附在树脂表面。
然后，根据逐渐增加溶液的离子强度，使得生物物质逐渐从树脂上脱离下来。
通过这样的多次处理，离子交换可以获得比较纯的生物物质。
透析是另一种分离技术。
其基本原理是根据不同大小的分子通过不同大小和孔径的透析膜来进行过滤分离。
透析膜的孔径通常比生物物质小，这使得生物物质可以通过，而较大的分子则无法通过。
层析是一种分离和纯化技术。
其基本原理是将混合样品注入到含有不同固定相的层次柱中，根据各种机制，在柱中形成不同的化学分析区段。
通过轻重分离，生物物质被不同的区段结合，直到最终获得纯化的物质。
电泳是一种根据电荷或大小分子的不同来进行分离的技术。
这种技术需要用到电极，将溶液浸泡在盐桶中，然后试管中的分子通过盐桶电极的分离进入试管腔。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
药物分离纯化的一般工艺流程
我们使用精纯层析这一术语描述在生物制药生产的最后阶段去除少量杂质的过程。
本
文介绍精纯步骤设计过程中应考虑的因素，从基本问题到面临的典型挑战，均有涉及。
什么是精纯层析，何时需要使用精纯层析？
在生物制药生产的下游生物工艺阶段，层析捕获的第一步是将产品与大部分杂质（例
如细胞培养基组分和蛋白酶）分离开来。
第二步是精纯层析，即去除剩余杂质，获得
更高纯度的目标分子（图 1）。
减少杂质最高效的办法是在开始纯化时尽可能地采用亲和步骤作为捕获的第一步。
在
单克隆抗体生产中，蛋白 A 亲和层析是广泛采用的捕获步骤。
经过该第一步纯化后，
纯度可以达到 95% 以上，这意味着只需进行有限的精纯即可进入最终的配制步骤。
但是，大部分涉及抗体相关产品（mAb、双特异性抗体、Fab 片段）及其他重组蛋白的工艺在捕获步骤完成后，都需要至少两个精纯步骤。
对于部分其他类型的分子，有时可能无法获得所需的亲和层析溶液。
目前尚无令人满
意的溶液可去除纯化后所有的痕量标签蛋白，因此生物制造中基本不考虑采用标签蛋
白质纯化。
如果无法获得目标分子纯化所需的亲和层析溶液，应设计第二步纯化以去除大部分工
艺和产品相关杂质，例如高分子量 (HMW) 杂质、宿主细胞残留蛋白 (HCP) 和 DNA。
如果捕获步骤不采用亲和层析，则捕获与最终精纯步骤之间的步骤也可称为“中度纯化”（图 1）。
药品生产过程中的药物提取与纯化技术
优点：操作简单， 成本低，适用于 热稳定性好的药
物。
缺点：需要较高 的温度，可能会 破坏药物的结构
和活性。
应用：常用于提 取挥发性药物， 如薄荷油、樟脑
等。
原理：利用超临界流体的溶解能力来提取药物 优点：高效、环保、无溶剂残留 应用：广泛应用于天然药物、合成药物和生物药物的提取 注意事项：需要精确控制温度和压力，以防止超临界流体的相变和分解
制定质量标准的依据：药品生产质 量管理规范（GMP）、药品注册管 理办法等法律法规
质量标准的实施：通过生产过程中 的质量控制措施，确保药品的质量 符合标准要求
添加标题
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质量标准的内容：包括药品的纯度、 杂质含量、稳定性等指标
质量标准的修订：根据药品生产和 监管的实际情况，对质量标准进行 修订和完善
原料质量控制：确保原料的质量和纯度 生产过程控制：监控生产过程中的温度、压力、时间等参数 产品质量检验：对提取和纯化后的药物进行质量检验，确保其符合标准 环境质量控制：保持生产环境的清洁和卫生，防止污染和交叉污染
提取方法：水煎煮法、醇提法、水 醇法等
实例：黄连提取与纯化、人参提取 与纯化、当归提取与纯化等
,
汇报人：
定义：从药物原料 中分离出有效成分
的过程
提取方法：溶剂提 取、水蒸气蒸馏、 超临界流体萃取等
目的：提高药物的 纯度和疗效，减少
副作用
提取设备：提取罐、 离心机、过滤器等
药物纯化的目的：确保药物的 安全性和有效性，减少不良反 应，提高药物的稳定性和保质 期。
药物纯化的定义：通过物理、 化学或生物方法将药物中的杂 质去除，提高药物的纯度和质 量。
原理：利用溶剂对药物成 分的溶解能力进行提取
生物药物的分离纯化
（4）凝胶过滤色谱 凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分 离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大 分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可 使大分子与小分子分开。 3、非蛋白质类杂质的去除 非蛋白质类杂质不应忽视，在纯化过程中，需特别注 意3种可能存在的非蛋白类杂质，它们是DNA、热原质 和病毒。 （1）DNA的去除 （2）热原质的去除 （3）病毒的去除
（3）固液分离：离心沉淀是固液分离的主要 手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过 滤技术有微滤、超滤和反渗透等。 2、目的产物的分离纯化 主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交 换色谱、疏水色谱、反相色谱。亲和色谱、凝 胶色谱、高压液相色谱等。 蛋白质纯化方法的设计通常是根据产物分子的 物理、化学参数和生物学特性进行的。 选择纯化方法应根据目的蛋白质和杂蛋白的物 理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要 的是表面性质的差异。
（1）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC） 基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换 的离子进行交换，从而达到分离的目的。 蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的 性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交 换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。 （2） 反相色谱（reversed phase chromatography,RPC）和疏 水色谱（hydrophobic interaction chromatography,HIC） 反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯 化的。 （3）亲和色谱（ affinity chromatography,AC） 亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物 亲和力进行吸附的 。亲和色谱的过程大致分为3步：第一 步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。
药物纯化的原理和方法
药物纯化的原理和方法药物纯化是指对含有不纯物的药物进行分离和提纯，以达到提高纯度和纯品的目的。
药物纯化的原理和方法涉及多种分离技术和纯化方法，包括物理方法、化学方法和生物方法等。
物理方法是最常用的药物纯化方法之一，其中最常见的方法包括结晶、沉淀、蒸馏和萃取等。
结晶法是一种将溶液中溶质通过结晶形成晶体的方法，通过控制溶液的温度、浓度、碱度等参数，可以使溶质与溶剂结合形成晶体，并通过过滤和洗涤等步骤分离纯品。
沉淀方法是靠溶液中的溶质与其他物质反应产生离子或沉淀物，再通过过滤和洗涤等步骤将纯品分离出来。
蒸馏法是利用物质的不同挥发性，在不同沸点下将溶液中的溶质蒸发除去，再通过冷凝回收纯品。
萃取法是利用溶质在两个不同的溶剂中的分配系数差异，通过多次抽提和回流的过程，将溶质从混合物中分离出来。
化学方法是根据药物化学性质的差异进行纯化的方法，如酸碱中和、氧化还原、配位等。
酸碱中和是将药物中的酸、碱与适当的反应物进行反应，生成水溶性的盐或盐类物质，再通过洗涤和结晶等步骤将纯品分离出来。
氧化还原方法是利用药物在氧化和还原条件下的性质差异，通过氧化或还原反应将杂质转化为易于分离的物质，再通过过滤和洗涤等步骤分离纯品。
配位方法是利用药物中含有的官能团（如羟基、羧基等）与配体形成络合物，通过络合物的成分和溶解度的差异将纯品分离出来。
生物方法是利用生物技术和生物分离方法对药物进行纯化。
其中最主要的方法是利用蛋白质纯化技术，包括电泳、层析和过滤等。
电泳是利用电场将药物中的不同带电的分子按照大小和电荷的差异迁移到不同位置，从而实现分离和纯化。
层析是一种将混合物通过吸附、凝胶和分子筛等材料的柱子进行分离的方法，根据分子在不同相（固相和流动相）中的亲和性差异，逐步分离纯品。
过滤方法是利用孔径大小和分子大小的差异，通过过滤材料将纯品和杂质分离。
除了以上的主要纯化方法，还可根据药物的特性和需求采用其他更专业的方法，如凝胶过滤、逆流色谱、超高速离心和冷冻干燥等。
生物活性物质的提取与纯化技术
生物活性物质的提取与纯化技术随着生物技术的不断发展，越来越多的人开始关注生物活性物质的提取与纯化技术。
这些生物活性物质，可以是来自植物、动物、细菌等生物体内的物质，也可以是人工合成的化合物。
这些物质有着广泛的应用价值，包括药物、化妆品、食品等领域。
因此，如何高效地提取和纯化这些物质，成为了一个研究热点。
一、生物活性物质的分类在深入探究生物活性物质的提取和纯化技术之前，我们先来了解一下生物活性物质的分类。
生物活性物质可以根据其来源分为天然物质和人工合成物质。
天然物质是指来自自然界中的化合物，可以是来自植物、动物、细菌等生物体内的物质。
人工合成物质是指人工合成的化合物，通常具有与天然物质相似的结构和生物活性。
此外，生物活性物质还可以根据药理作用和分子结构等进行分类。
根据药理作用，生物活性物质可以分为抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等不同类型。
根据分子结构，生物活性物质可以分为生物碱、多糖、皂苷、黄酮类等不同类型。
二、生物活性物质的提取技术生物活性物质的提取是指从生物体中分离出目标物质的过程。
提取技术的选择，主要取决于目标物质的性质、来源、生物体数量、成本等方面。
1. 浸提法浸提法是目前常用的提取技术之一，该技术可以在没有分析和分离步骤的情况下提取出目标物质。
浸提法在技术上比较简单，但提取效率相对较低，因为它通常需要大量的溶剂和时间。
2. 蒸馏提取法蒸馏提取法是将混合物中的目标物质与溶剂混合后加热，液体蒸发成气体，随后将气体冷却成液体，达到目标分离的技术。
该技术在提取香料和草药方面得到了广泛应用。
3. 超声波辅助提取法超声波辅助提取法是将试样与溶剂混合，并将混合物置于超声波波浪的环境中，利用超声波的机械作用、热效应和微流动效应提取目标物质的技术。
该技术提高了提取效率和速度，并且在机理研究和优化提取条件方面也具有很大的优势。
三、生物活性物质的纯化技术生物活性物质的纯化是指将获得的混合物中仅含目标物质的纯品分离出来的过程。
生物活性物质的提取和分离技术
生物活性物质的提取和分离技术生物活性物质是指可以对生物体产生生理、药理或者化学影响的物质。
生物活性物质广泛存在于植物、动物和微生物中，具有广泛的生物效应，如抗炎、抗菌、抗肿瘤等。
因此，生物活性物质的提取和分离技术在生物药物研究和生产中具有重要的意义。
一、提取技术生物活性物质的提取技术是指从生物体中提取出有效成分的过程。
提取技术包括传统的浸提、浸泡、水蒸气蒸馏、微波提取等方法，以及新型的超声波提取、PFE萃取等方法。
浸提法是利用溶剂将需要提取的成分从原料中分离出来。
将细粉末或切碎的原料与溶剂混合后，静置一段时间使其充分浸泡后，通过过滤或离心分离出溶液，即可得到提取物。
浸提法操作简单，但是提取效率低。
PFE萃取技术是以二氧化碳为萃取剂，通过高压和高温条件将二氧化碳转变成超临界流体，使溶剂和矩阵中物质的溶解性增大，从而实现萃取。
该技术提取效率高，适用于多种原料。
但是，在反应过程中，需要对压力和温度严格控制，操作较为复杂。
二、分离技术从提取物中分离出纯化的生物活性物质是生物活性物质研究中重要的一步。
分离技术包括色谱技术、电泳技术、过滤技术等。
色谱技术是分离生物活性物质的传统方法之一。
常用的色谱技术包括薄层色谱、GC、HPLC等。
其中，HPLC是目前最常用的色谱技术。
该技术可以对混合物进行精确分离，分离效率高，且操作简单。
电泳技术是一种采用电场作为驱动力的生物分离技术，适用于分离蛋白质、核酸等大分子生物活性物质。
常用的电泳技术包括SDS-PAGE、蛋白质电泳等。
该技术分离程度高，分离结果精确。
三、结合技术在实际应用中，生物活性物质的提取和分离技术往往会结合多种技术进行。
如超声波辅助萃取结合薄层色谱技术等。
该方法操作简单，适用于多种原料，提高了生物活性物质的提取效率及纯化程度。
总之，生物活性物质的提取和分离技术是生物药物研究和生产的重要的前提。
随着科技的发展，越来越多的新型技术被应用于生物活性物质的提取和分离中，加速了生物活性物质的研究进程。
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• 氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解 质。它们具有等电点，在离开等电点的pH 时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电 点为7.0，当溶液pH为4.0时，分子则带有 正电荷。由于具有该性质，利用带电性质 进行分离是极其有效的方法。
利用蛋白质带电性质行分离的方法有： • 离子交换柱层析法； • 电泳法； • 等电聚焦法。
• 非降解法：适用于从含一种粘多糖的动物 组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水 或盐溶液。
• 降解法：适用于从组织中提取结合比较牢 固的粘多糖。例如从软骨中分离提取硫酸 软骨素，就是用碱处理进行降解，又如用 酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。
• 常用的分离纯化多糖的方法是乙醇沉淀法 和离子交换层析法。
• 原料的选择还要注意如下事项：植物原料 要注意植物生长的季节性，选择最佳采集 时间；微生物原料要注意微生物生长的对 数期长短；动物原料有的要注意动物的类 别、年龄与性别。
• 也应注意原料的采集地和批次。
• 动物原料采集后要立即处理，去除结缔组 织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；植物 原料确定后，要择时采集并就地除去没有 用的部分，将有用部分保鲜处理；收集微 生物原料时，要及时将菌体细胞与培养液 分开，进行保鲜处理。
• 注意从粗多糖中除去蛋白常用的方法有： Sevag法、三氯乙酸法和蛋白酶解法。
• *二乙氨基乙基纤维素
• (1) 提取方法 脂类自然状态下是以结合形 式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或 蛋白质分子的疏水区相结合的。因此，提 取脂质药物就是要选择适当的溶剂来破坏 这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶 剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此 外还有氯仿、甲醇、水等。
• 原料的保存方法主要有：①冷冻法。该 方法适用于所有生物原料。常用-40℃速 冻。②有机溶剂脱水法。常用的有机溶 剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、 有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原 料，如脑垂体等。③防腐剂保鲜。常用 乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料， 如发酵液、提取液等。
• (1) 生物组织与细胞的破碎 • (2) 生物组织细胞破碎后立即进行提取
(2) 纯化方法
• 沉淀法：由于不同脂质在丙酮中溶解度 不同，故常用它进行沉淀。
• 吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、氧化 铝等。它是通过极性和离子键力等把各 种化合物结合到固体吸附剂上。一般是 采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非 极性组分先流出，极性组分后流出。
• D.超声波振荡破碎法，该方法破碎效果较 好，但由于局部发热，对活性有损失。
• E. 自溶法或酶解法，用得较少。
• 生物组织活性物质的提取要在细胞破碎后 立即进行。
• 提取过程中
• （1）要根据活性物质的性质，选择提取 试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、 盐溶液、乙醇、其他有机溶剂(如氯仿、丙 酮等)。
• 生物药物大部分存在于生物组织或细胞中， 要提高提取率，对生物组织与细胞的破碎 过程是非常重要的。
• A. 磨切法，该法属于机械破碎方法，使用 的设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、 匀质机、球磨机、乳钵等。
• B. 压力法，这类方法有加压与减压两种， 常用的法兰西压釜使用效果良好。
• C. 反复冻融法，该方法设备简便，活性保 持好，但用时较长。
பைடு நூலகம்
• 核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵 法。
• 提取法生产DNA和RNA的主要技术是，先 提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与 蛋白质，然后分离RNA与DNA。
• 发酵法主要用于生产单核苷酸。
• 由于各种糖类药物的性质和原料来源不同， 没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只 介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。
• 蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。该 法的原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而 沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂 沉淀法、等电点沉淀法、与靶物质结合沉 淀法(如抗体一抗原)等。
• 这类方法有超滤法和透析法(即膜分离方法)、 凝胶层析法、超速离心法等。其中膜分离 法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和 脱盐。
生物药物的分离纯化和提取方式
• 1.生物药物原料的选择、预处理与保存方法 • 2. 生物药物的提取 • 3. 蛋白质类药物的分离纯化方法 • 4. 核酸类药物的分离纯化方法
• 5. 糖类药物的分离纯化方法 • 6. 脂类药物的分离纯化方法 • 7. 氨基酸类药物的分离纯化方法
• 生物药物生产原料的选择原则主要是：(1) 有效成分含量高，原料新鲜；(2)原料来源 丰富，易得，原料产地较近；(3)原料中杂 质含量少；(4)原料成本低等。但是，同时 具备这4种有利因素的原料不多，生产研究 者可酌情选择，但第一条是最重要的。
• 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质， 如酶与底物(或抑制剂)、抗原与抗体、激素 与受体等，它们之间有特异的亲合作用， 利用该性质设计的特异层析分离技术称为 亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作 简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。
• 亲和层析法主要包括：疏水反应层析、金 属螯合层析、免疫亲和层析、共价亲和层 析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和 层析等。亲和层析技术大量应用于蛋白质 分离和纯化。
• 乙醇沉淀法是从提取液中沉淀多糖的最简易 方法，也适用于分级分离。用4～5倍体积的 乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉 淀。
• 季铵化合物也可用于沉淀粘多糖,其原理是 粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性 剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基 铵(CTA)等。
• 离子交换层析法：粘多糖的聚阴离子能够 很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如 Dowex-I-X2 离 子 交 换 树 脂 、 DEAE- 离 子 交换纤维素*等。洗脱可用NaCl溶液进行 梯度洗脱。
• （2）考虑提取溶剂的用量（料液比）及 提取次数、提取时间。
• （3）注意提取的温度、pH、变性剂等 因素。这样才可以保证活性物质提取充 分而且不变性。
• 蛋白质类药物主要包括蛋白质、多肽和酶 类等药物。它们的分离纯化方法有：
• (1) 沉淀法 • (2) 按分子大小分离的方法 • (3) 按分子所带电荷进行分离的方法 • (4) 亲和层析法