冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理32页PPT
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
• 组织学结构的熟悉…… • 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增 生、凋亡…… • 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度……
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– 常规HE染色 – 特殊染色
• 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
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(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。 ③使用已变色的显色底物溶液，或显色反 应时间过长。 ④抗体温育的时间过长。
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ห้องสมุดไป่ตู้
4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关 键环节
试剂公司提供标准化的试剂
• 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定 2-4h（ 4℃冰箱）
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减少冰晶的形成
• 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 • 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶， 为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
实验五-冰冻切片法ppt课件
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四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
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五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在 标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
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三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。
切取的组织不能过大，组织过大
快速，用时短。
不容易冻结或者组织冻结不均，
影响切片及染色效果。
组织变化不大。
能很好保存脂肪，类脂等成分。
不容易制作较薄的切片。
能够比较完好地保存各种抗原活性及 组织块在冻结过程中容易产生水
酶类，特别是对于那些对有机溶剂或
的结晶而影响细胞的形态结构及
热的温度耐受能力较差的细胞膜表面
.
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半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
.
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一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
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二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
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抗原物质的定位，并且组织结构
抗原和水解酶保存较好。
也不如石蜡切片清晰。.Fra bibliotek3冰冻切片的适用范围
冷冻切片常见问题分析与预防
冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。
它是术中诊断的一种重要方法。
但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。
归结起来有以下几方面。
1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。
切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。
导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。
1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。
1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。
1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。
1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。
1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。
冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。
!组织大小要适中。
冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。
一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。
另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。
#掌握好冷冻时间。
根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。
冷冻切片技术课件ppt
现代的冷冻切片技术已经实现了自 动化、数字化和标准化，为医学研 究和诊断提供了强有力的支持。
应用领域
临床病理诊断
冷冻切片技术可用于手术中的快 速病理诊断，帮助医生确定病变 的性质和范围，为手术方案提供
重要依据。
教学
冷冻切片技术可用于制作教学标 本，为医学生和病理医生提供直
观的学习材料。
科学研究
二氧化碳冷冻喷射固定设备。
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冷冻固定设备的特点
冷冻固定设备具有操作简便、冷冻速度快、温度低等特点，能够有效地
保持组织或细胞的结构和成分不变。
切片机与刀片
切片机
切片机是用于将冷冻固定的组织或细胞样品进行切片的仪器。其工作原理是通过将组织或 细胞样品放置在切片机的工作台上，利用机械或激光等方式将样品切成薄片。
生物科学研究
利用冷冻切片技术进行细胞结构和功能的深入研 究。
药物研发
利用冷冻切片技术评估药物对细胞的作用机制。
发展前景展望
自动化与智能化
01
通过自动化与智能化技术的引入，降低冷冻切片制备的难度和
操作成本。
高分辨成像
02
发展高分辨成像技术，以获得更清晰、更深入的细胞结构和功
能信息。
跨学科，如生物工程、神经科学
将切片贴在载玻片上
将切好的切片贴在预处理的载玻片上，使其平整、无气泡。
干燥与固定
使切片在室温下干燥，并进行必要的固定处理，如用醛类化合物 进行醛化处理，以增强切片的稳定性。
染色与观察
染色
根据研究或诊断需求，选择适当 的染色方法对切片进行染色，如 H&E染色、免疫染色等。
观察
用显微镜观察染色后的切片，根 据需要调整焦距和光源强度，观 察并记录组织结构和细胞成分等 细节信息。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冰冻切片法ppt课件
方法：
• 切片固定30秒－1分钟。 • 水洗。 • 染苏木素3－5分钟。 • 分化。 • 于碱水中返蓝20秒。 • 伊红染色10－20秒。 • 脱水，透明，中性树胶封固。
操作过程中常见问题与处理
标本固定应充分
• 标本经固定或不固定均可，但经过固定的组织切片冰晶少 ，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰，而未固定的组 织冰晶多，细胞挤压变形大，甚至会影响观察结果。因此 ，除特别需要外，一般较多采用组织固定后再行切片。固 定方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活检和手术标 本，以及其它不能进行灌注的组织固定。灌注法适用于动 物实验研究。用于组织固定的固定剂种类很多，包括醛类 、非醛类、丙酮及醇类等，其中以中性缓冲液配制多种聚 甲醛较为常用2’，- 3组织固定时，一方面固定液要有足 够的量，另一方面还要保持一定时间，一般在快速灌注固 定取材后，多用相同的固定剂再固定! % " ，以使组织充分 固定，这对保持切片的完整性尤为重要。
不甚清晰, 背景模糊。 通过使用两种不同固定方法结果的比较, 我们认为 双重固定液法在冰冻切片中应用良好, 明显优于Clarke 氏单液固定法, 值得推 广应用。
合成胶水的影响
• 临床病理工作中经常遇到一些微小组织做冰冻切片,我们 体会到,异体脏器组织包埋法中的异体脏器组织存留在载 玻片上,不易擦除干净,留有背景对切片外观有影响,时有微 小组织与异体脏器组织间包埋时易产生间隙,给切片带来 不便。石蜡包埋托法往往因包埋托有一定厚度影响冷冻时 间,而且仍然需要OCT 包埋剂。合成胶水水溶性好,与组织 结合紧密,二者形成完整整体,而且冷冻后硬度相当,利于切 片,切片上的胶膜水洗后完全溶解,不会造成污染和遗留背 景色。合成胶水用量少,冷冻时间短,组织不会形成冰晶 , 因此镜检时细胞形态完整,染色清晰。合成胶水来源简便 、经济、冷冻快速。实为一种实用的替代方法。
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
每台冰冻切片机都有 一个速冻台，好的冰 冻切片机可以在几分 钟内将速冻台的温度 下 降 至 -50℃ ～ -60℃ 度之间。
冷冻锤从上面压在组 织上，可以使组织上 下两面同时冷冻
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一台冰冻切片机有多个冷冻锤
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6、液氮和急冻剂
使用液氮和急冻 剂来快速冷冻组织
7、专用冷冻机
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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一、冰冻切片制片中冰晶的问题
冰晶的产生：当组织缓慢冷冻时，组织间隙的 水份凝固形成的，这时由于电解质析出，渗透压 升高，细胞内的水分子渗透到细胞外，使组织间 隙的冰晶变得更大，挤压周围组织，使组织细胞 的形态发生明显的改变，严重影响病理诊断。
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液：
苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水 730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml.
（2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
5、购置专用冷冻机、急冻剂、专用液氮灌
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二、常规与冰冻制片中常见问题
切片染色的问题
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理精品PPT课件
– 未经固定的脑组织、肝组织：-10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织：-15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
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保持切片的完整性
• 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
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防止切片卷缩
• 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
• 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
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同一载玻片上 • 包括各个所有组 • 染色齐性
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为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间? 判定？）
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