细胞培养工作流程
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程细胞培养是一种将动植物细胞在体外条件下进行繁殖和生长的技术。
它是许多生物学研究和应用领域的重要工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药物研发、生物工程等领域。
细胞培养的工作流程包括以下几个主要步骤：2.细胞株的建立：细胞株是一组具有相同遗传特性的细胞，通常可以通过原代培养、扩增和传代等方法建立。
原代细胞通常来自新鲜组织，将其接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中，细胞在适宜条件下会开始生长和分裂形成细胞株。
3.细胞培养基的选择：细胞培养基是提供细胞生长和繁殖所需的营养物和生长因子的培养介质。
根据不同细胞类型的要求，可以选择不同的培养基配方。
培养基常见的成分包括无菌水、氨基酸、糖类、脂质、无菌血清、维生素等。
4.细胞的传代：细胞在培养皿中进行繁殖和分裂，当细胞密度达到一定程度时，需要将细胞进行传代以保持细胞的健康和增殖能力。
传代的目的是将细胞分离并分散在新的培养皿中，以便细胞可以继续生长和繁殖。
5.细胞的准备和植入：根据实验设计和研究目的，将所需的细胞接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中。
细胞培养条件通常包括适宜温度（通常为37摄氏度）、无菌条件、恒定的pH值、适宜的气氛（如5%CO2），以及提供细胞所需的营养物和生长因子。
6.细胞的观察和维护：细胞在培养过程中需要定期观察其生长状态和形态特征。
可以使用显微镜对细胞进行观察和记录，以判断细胞的健康和增殖情况。
细胞的培养过程中还需要定期更换培养基，补充营养物和生长因子，以维持细胞的正常生长和繁殖。
7.细胞的实验应用：培养的细胞可以用于各种不同的实验研究和应用，包括细胞分离、细胞特征分析、药物筛选、基因表达研究等。
在实验中，细胞可能需要通过一些特殊处理，如细胞冻存、细胞分离、染色等。
细胞培养整体流程
细胞复苏（快融）准备工作：1ml 灭菌Tip一盒，DMEM，D+F+P（DMEM90%+FBS10%+PS400µl），1.5ml离心管，水浴锅（42℃）1、25mm小皿各加入1mlD+F+P，置超净台预热备用，1.5ml EP管各加入500ulD+F+P；2、液氮中取出冻存管（注意不要用手直接触摸冻存管袋），置于水浴锅42℃快融，一般为2min（具体情况看冻存管溶解状况）；若在-80℃取出，40℃快融。
3、将1.5ml冻存液（1350ul细胞悬液+150ul DMSO）离心，1000rpm,5min离心，弃上清。
4、将超净台中的D+F+P加入离心管，吹散底部沉淀（轻轻吹打）；5、将细胞悬液加入培养皿中，注意点样均匀，镜检，入箱培养。
细胞传代70~80%时就可以传代1、吸去原培养基，用基础培养基洗2次（大皿每次1ml）；2、0.25%胰酶（小皿600µl，大皿1ml，依据情况而定），静置1~2min（依据细胞贴壁状况而定）；3、吸去胰酶，可静置，胰酶残留物进一步消化；4、加D+F+P（DMEM90%+FBS10%+PS400µl）1ml（可进一步阻止胰酶），轻轻吹打（需沿同一方向吹打，不可产生气泡）；5、取出新培养皿分别标清细胞类型、时间、人物以及传代次数，并且加入1ml培养基；6、取200µl平均点缀至大皿，均匀加至各部分，8字晃匀；7、显微镜观察细胞状态以及是否铺匀，入箱培养。
细胞冻存（慢冻）准备工作工作液：每次使用前配制，用多少配多少 10%DMSO+90%D+F+P（DMEM90%+FBS10%+PS400µl）1、吸去原培养基，用基础培养基洗2次（大皿每次1ml）；2、0.25%胰酶（小皿600µl，大皿1ml，依据情况而定），静置1~2min（依据细胞贴壁状况而定）；3、吸去胰酶，可静置，胰酶残留物进一步消化；4、加工作液1ml（可进一步阻止胰酶），轻轻吹打（需沿同一方向吹打，不可产生气泡）；5、取出冻存管分别标清细胞类型、时间、人物，加500µl配好的工作液，终体积1.5ml；6、放置4℃（包棉花）放在PE手套，头向上10min，然后转至-20℃放置40min，再到-80℃过夜（最多保存1个月），最后放置到液氮中。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1、1工作地点检查:检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。
1、2设施检查:确认空调、传递窗工作状态完好。
1、3层流罩准备:开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1、4操作工具与试剂检查:检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液。
1、5复苏用水准备:(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备39±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36、5±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
1、6操作人员进入层流罩:穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。
1、7溶液使用前处理:辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领依据种子库管理规定进行支领,依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
实验室细胞培养的一般步骤
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程细胞培养指的是将体外细胞放入适宜的培养基中，通过人工控制环境提供养分、温度、湿度和气氛等条件，使细胞能够在体外生长和繁殖的过程。
它是现代生物科学研究的重要手段之一、下面是细胞培养的基本工作流程：1.选择细胞系：根据研究目的，选择合适的细胞系进行培养。
常用的细胞系包括动物细胞系（如人类细胞系、小鼠细胞系）和植物细胞系（如拟南芥细胞系、水稻细胞系）等。
2.培养皿处理：将培养皿（常用的有细胞培养板、细胞培养瓶等）进行反应器瓶内蒸气温度消毒，消毒完后平行设置以备用。
3.准备培养基：根据细胞系的要求，配制适合的培养基。
培养基可以分为基本培养基和特殊培养基两种。
基本培养基是常规使用的培养基，包含至少4个组分：基础培养液（如DMEM、RPMI1640等）、热灭菌的胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和培养液调节剂。
特殊培养基则根据细胞系的需要，添加特定的因子和配方，以满足特殊细胞的生长和繁殖要求。
4. 细胞接种：将细胞接入培养皿中。
首先需要将细胞接种得到的细胞进行计数，根据细胞密度和细胞系特性合理的安排接种密度。
常规的细胞接种密度为1×10^5 到5×10^5个细胞/ml。
然后将培养基加入培养皿中。
5.培养条件控制：将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的环境条件。
常见的条件有：温度通常为37℃，CO2浓度通常为5%，相对湿度约95%。
这样可以提供适宜的温度、气氛和湿度，保证细胞正常生长和繁殖。
6.细胞观察和维护：每天对细胞进行观察、记录和维护。
观察细胞的形态、增殖情况和污染情况等。
细胞一般分为贴壁生长和悬浮生长两种，贴壁细胞需要定期更换培养基，悬浮细胞则需要掌握细胞的密度从而进行传代。
7.细胞传代：当细胞密度到达一定程度（通常为80-90%）时，需要进行细胞传代，以维持细胞的生长和繁殖。
传代的方法包括机械切割、酶解等。
细胞传代的时机和方法由细胞的适应性和特性决定。
8.细胞冻存：为了保证细胞库的保存和维持，需要进行细胞的冻存。
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细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。
设施检查：确认空调、传递窗工作状态完好。
层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、%NaHCO3溶液。
复苏用水准备：（1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含%新洁尔灭溶液。
（2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备±1℃含%新洁尔灭溶液。
操作人员进入层流罩：穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。
溶液使用前处理：辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：～ ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。
4、种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。
核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。
然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。
同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。
迅速传递并浸入百级内±1℃含%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。
5、移种操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。
6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。
24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。
7、清场将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间，层流罩内用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。
8、复苏后观察第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。
9、换液换液前准备与复苏前相同。
观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。
用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。
辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。
操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。
辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：～ ml/cm2）。
拧紧瓶口，平放到恒温室培养。
最后按规定清场二、细胞传代流程1、准备工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。
设施检查：确认空调、蠕动泵工作状态完好。
层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
细胞传代用液体：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、%NaHCO3溶液、溶液、细胞消化液（含%的胰蛋白酶溶液）。
2、传代1操作配液配方向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、%NaHCO3。
辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。
注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。
洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：30ml/ T75 cm2瓶。
（加量：～ ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：~ ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置±℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打开，用吸管吸10ml至T75 cm2瓶中，用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。
注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。
分种操作人员将细胞悬液平均分种至2个T175 cm2培养瓶中，，加生长液至75ml。
培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
清场按规定清场观察每天观察细胞生长状态3、传代2操作配液配方向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、%NaHCO3。
辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。
注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。
洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。
（加量：～ ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：~ ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置±℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打开，将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。
注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。
分种操作人员将细胞悬液平均分种至8个T175 cm2培养瓶中，加生长液至75ml。
培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
清场按规定清场观察每天观察细胞生长状态4、传代3操作配液配方辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松动，一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境。
辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内，加完后混匀待用。
然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。
注意事项：无菌吸管使用过程中禁止接触其他部位（除吸管后端的任何位置），如不慎碰到应立即废弃。
安装管道过程中，如管道不慎碰到其他部位应立即废弃。
洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。
（加量：～ ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：~ ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置±℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打开，将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。
然后将8个培养瓶的细胞合并到1个T175 cm2瓶中。
用传液管道吸入MEM中，混匀待用。
注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。
分种辅助人员将10层细胞工厂盖子打开，操作人员将连接管道出液口处的细胞工厂转接头无菌取出后与细胞工厂左端口对接，并将细胞工厂横放在操作台上，同时将细胞工厂右端的盖拧松。