同源克隆结合RACE技术扩增基因全长
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
龙眼体细胞胚胎发生过程中DlWUS的克隆与表达分析
龙眼体细胞胚胎发生过程中DlWUS的克隆与表达分析张冬敏;田奇琳;杨曼曼;林玉玲;赖钟雄【摘要】以龙眼‘红核子’LCc悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织为基本材料,按照龙眼体细胞胚胎同步化方法诱导获得龙眼体胚不同阶段材料,并以龙眼体细胞胚胎发生不同阶段混合材料作为试验材料,采用RT PCR结合RACE技术分离并克隆龙眼中编码同源异型结构域蛋白的转录因子WUSCHEL(简称DlWUS)的cDNA全长及DNA序列,并进行序列分析与表达分析.结果表明:DlWUS的cDNA全长1 110 bp,开放阅读框(ORF)858 bp,共编码285个氨基酸(GenBank登录号为KM017506),DlWUS的DNA包含2个内含子.序列分析表明,DlWUS是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,亚细胞定位于细胞核,具跨膜结构和Homeodomain超级家族的保守结构域以及WUS转录因子家族特有的WUS box和EAR-like结构域,推测该目的基因确实为WUS转录因子.系统进化分析显示,龙眼DlWUS与脐橙WUS归为一个分支,亲缘关系较近.实时荧光定量PCR分析结果表明,在龙眼体细胞胚胎发生整个过程中,DlWUS均有表达,但仅在球形胚时期表达量较高,说明DlWUS 可能主要在球形胚阶段发挥作用,并且在一定浓度范围内,外源施加IAA和GA3能够促进DlWUS基因的表达,而外源施加SA则抑制DlWUS基因的表达.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2015(035)005【总页数】8页(P890-897)【关键词】龙眼;体细胞胚胎发生;WUSCHEL;实时荧光定量PCR【作者】张冬敏;田奇琳;杨曼曼;林玉玲;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q789体细胞胚胎发生是植物体外再生的一种有效方法,目前已经有许多经济作物利用体细胞胚胎发生来获得体外再生植株,并且因为体细胞胚胎发生的生长发育过程类似于合子胚,所以也常常作为研究高等植物合子胚生长发育的模式材料。
RACE_一种研究新基因的有效方法
１ ＲＡＣＥ 技术的原理
ＲＡＣＥ 技 术 以 ｍＲＮＡ 为 模 板 ， 反 转 录 合 成 ｃＤＮＡ 的 第 一 条 链 。 然 后 用 ＰＣＲ 技 术 扩 增 出 从 某 个 特 定 位 点 到 ３′端 或 ５′端 之 间 的 未 知 核 苷 酸 序 列 ， 因 而 又 可 以 分 为 ３′ＲＡＣＥ 和 ５′ＲＡＣＥ 两 种 。 ３′ＲＡＣＥ 的 原 理 是 利 用 ｍＲＮＡ 的 ３′端 天 然 的 ｐｏｌｙ（ Ａ） 尾 巴 作 为 一 个 引 物 结 合 位 点 进 行 ＰＣＲ， 以 Ｏｌｉｇｏ（ ｄＴ） 和 一 个 接 头 组 成 的 接 头 引 物 （ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ， ＡＰ） 反 转 录 ｍＲＮＡ 得 到 加 接 头 的 第 一 链 ｃＤＮＡ。然 后 用 一 个 正 向 的 基 因 特 异 性 引 物 （ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ， ＧＳＰ） 和 一 个 含 有 部 分 接 头 序 列 的 引 物 分 别 与 已 知 序 列 区 和 ｐｏｌｙ（ Ａ） 尾 区 退 火 ， 经 ＰＣＲ 扩 增 位 于 已 知 序 列 区 域 和 ｐｏｌｙ（ Ａ） 尾 区 之 间 的未知序列。若为了防止非特异性条带的产生， 可采用巢 式 引 物 （ ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ） 进 行 第 二 轮 扩 增 ， 即 巢 式 ＰＣＲ （ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ） ［ ３］ 。
RACE技术
RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。
目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。
因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。
第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
山东大学2020—2021学年第1学期生物技术《现代分子生物学》考试试卷(附答案)
山东大学2020—2021学年第1学期
《现代分子生物学》考试试卷（A卷）
院/系年级专业姓名学号
考生答题须知
1．所有题目答题答案必须做在考点发给的答题纸上，做在本试题册上无效。
请考生务必在答题纸上写清题号。
2．评卷时不评阅本试题册，答题如有做在本试题册上而影响成绩的，后果由考生自己负责。
3．答题时一律使用蓝、黑色墨水笔或圆珠笔作答（画图可用铅笔），用其它笔答题不给分。
4．答题时不准使用涂改液等具有明显标记的涂改用品。
山东大学2020—2021学年第1学期《现代分子生物学》考试试卷（A卷）
标准答案。
RACE技术的原理和操作
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
编辑本段优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
编辑本段引物的设计基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
编辑本段反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR 反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
RACE技术
引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即
可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。
SMARTTM 3‘-RACE的原理
5'-RACE ：5'-RACE相对较难，目前流行几种5'RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自 己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩 增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在 PCR。还有，GENE公司一种 smartRACEPCR，利 用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模 板而无需用连接酶加接头。利用mRNA的3‘末端的
验证基因特异性引物的对照
利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个 GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。） 为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利 用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对 照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片 段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合 成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行 cDNA的合成。
SMARTTM 3‘-RACE的原理图
SMARTTM 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作为 一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作 为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转 录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具 有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链 的5’末端时自动加上3-5个（dC）残基，退 火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列 Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为 以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接 头。
反应中涉及到的一些事项
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的 特异性。在最开始的循环中，退火温度高于 AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的 扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的 温度，可以进行随后的PCR循环。
RACE引物设计原则
RACE引物设计原则用于RACE引物设计的原则引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的，如果引物的特异性不好，就会给实验带来许多麻烦，甚至扩增不到我们这实验预期想的目的产物。
以下是结合一些网上的资料和我们在多次实验中总结出的引物设计的原则。
兼并引物的设计用兼并引物扩增，一般是我们想克隆的物种中没有我们想要克隆的目的基因的信息，但在其它物种中是存在的，我们就可以将其它物种该基因的序列进行序列同源性比较，同源性高的区域就是兼并引物设计的侯选区；或是假如这些基因的核酸序列的同源性不高，没有合适的选择区域，则我们可以用将其它物种该基因的序列翻译成氨基酸序列，然后进行序列同源性比较，同源性高的区域一般是保守区，再用保守区氨基酸对应的核酸序列设计兼并引物，但兼并引物兼并度（即单条引物上各兼并碱基之和的乘积）应小于1000 ，且兼并引物的3’端应尽量减少兼并性，并使3’端最后6个碱基的G或C的含量大于50%，以提高特异性；此外，假如我们只知道氨基酸序列，则可根据不同物种密码子的偏好性来设计引物。
有部分碱基序列的引物设计对于用差异显示(Differential Display Reverse Tranion ,DDRT)或者抑制减法杂交（Suppressive Subtractive Hybridization ，SSH）、RNA指纹、EST芯片及兼并引物扩增等方法得到DNA片断，要克隆全长cDNA，或者用同源序列克隆其他物种中的同源基因，3'端的扩增一般都不成问题，难就难在5'端的片断扩增。
利用SMART技术将SMART引物自动加入cDNA的5'端，不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦，而且能得到全长的cDNA 5'端。
只要少至25个碱基的已知序列即可克隆出全长的cDNA[4]。
如你欲克隆的基因在GenBank已列出的26种生物中，且是多基因家族的一个成员，则应先上网进行BLAST(/BLAST)，为了提高扩增的特异性，应选择没有同源性的区域设计引物。
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同源克隆
根据实验要求和目的不同,有时只需要得到 基因片段,有时则需要得到基因全长.
gDNA基因全长:
cDNA基因全长:
同源克隆
如果需要得到基因全长,在克隆本物种中未 见报道的ication of cDNA ends）技术等方法.
PCR扩增基本程序
1. 94℃,4min 2. 94℃,30s 3. 60℃,30s 4. 72℃,1min 5. Go to step 2, 34cycle 6. 72℃,10min 7. 12℃,1h
悬铃木PaFT基因的克隆
四.模板准备 要求:提取高质量的DNA和RNA
悬铃木FT基因的克隆
RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)技术
基因同源克隆实例
二球悬铃木PaFT基因的克隆
从营养生长转向生殖生长是植物一生中最重要的 变化。 70年前，经典的植物生理学实验证明了叶片是植 物感受外界光信号的器官，但花的诱导则发生在 植物的茎尖，所以植物生理学界提出了一个″开花 素″(Florigen)的概念，认为有一种诱导开花的物质 从叶片转运到茎尖而诱导开花。科学家们一直致 力于寻找并证明这种物质的存在，但均以失败而 告终
同源克隆结合RACE技术扩增 基因பைடு நூலகம்长
同源克隆
这是一种参考其他物种的已知基因序列克 隆待研究物种目标基因的方法。目前很多 植物基因的序列信物，然后通过 的PCR方法进行克隆。
同源克隆
如果计划克隆的基因在本物种中已经有报道,那么 只需要在NCBI网站上的Nucleotide数据库中检索到 该基因序列,随后设计基因特异引物进行PCR扩增 即可. 如果计划克隆的目的基因在本物种中未见报道,则 可以以近源物种中报道的该基因序列检索数据库, 看是否能够比对到本物种的公布序列,从而设计基 因特异引物进行PCR扩增.如果无法比对到本物种 的表达序列,那么只有比对近源物种中所报道的该 基因序列从而设计基因简并引物进行PCR扩增.
悬铃木FT基因的克隆
二.比对cDNA序列
悬铃木FT基因的克隆
三.简并引物设计,扩增保守片段
FT1F:5’ ACT YTG GTH ATG GTK GAY CCW GAY G 3’ FT2F:5’ CAY TGG TTR GTB ACH GAT ATH CCW GC 3’ FTR:5’ G RCA RTT RAA RWA RAC RGC RGC MAC HGG 3’
注意事项
设计同源克隆的引物时，要控制引物的简并度。
设计RACE反应的特异引物时，引物的退火温度 尽量控制在≥62℃。 （常规引物的设计要点：引物长度控制在15-28bp 之间，ATCG四种碱基的尽量分布均衡，尽量保 证引物3’端的特异性，引物3’末端尽量不要出现 连续的CCC或GGG，引物最好不要以A作为末尾， 要避免形成发卡结构或二聚体）
在设计FT同源基因的简并引物时,首先从NCBI中检 索了约10个双子叶物种的FT同源基因序列,重点参 考其中的四个木本植物FT同源序列设计简并引物.
序列比对使用的软件是Vector NTI 9.0,也可以使用DNAman或是DNAstar 等软件.
悬铃木FT基因的克隆(同源克隆)
一.比对氨基酸序列
FT/TFL基因家族
随着分子生物学的发展，逐步在模式植物拟南芥 中发现一系列基因参与了植物对外界光信号的感 应。拟南芥对于长光照的反应依赖Constans(CO) 基因，但CO基因只能在叶片中诱导开花，而不能 在茎尖中直接诱导开花。CO基因促进开花的作用 又进一步依赖于其下游基因FT。有人通过构建FT 基因的诱导性表达载体，发现只需要在一个叶片 中诱导FT表达就足以促使植株开花，同时证明了 FT蛋白可以从叶片转运到茎尖生长点。这是首次 从分子水平证实了开花素的存在。
五.根据所得到的300bp片段设计Race反应的基 因特异引物
设计特异引物使用的软件是Primer Premier 5.00
扩增片段经测序比对之后证实是 PaFT基因的5’末端和3’末端
悬铃木FT基因的克隆
六,根据Race反应所得到的FT5’3’UTR序列 设计基因特异引物,分别以gDNA和cDNA为 模板进行PCR扩增,从而得到了FT基因的全 长.
注意事项
进行同源克隆时，最好设计扩增的目的条 带存在50bp以上的长度差异的嵌套引物。
注意事项
进行同源克隆或是RACE扩增时，一定要做 单引物对（组织部位，发育时期）。
做实验要有耐心，要越挫越勇。当RACE实 验进展不顺利时，尝试调整PCR程序中的引 物退火温度以及循环数。
FT/TFL基因家族
杨树是木本模式植物，自然界中杨树要生 长20年左右才能开花。组成型表达的FT同 源基因可以诱导杨树提前开花，转FT同源 基因的杨树可以在转化后四周内即组织培 养阶段开花。该成果可以广泛应用于多年 生木本植物上从而加快常规育种进程.
二球悬铃木PaFT基因的克隆
悬铃木科现存只有1属—悬铃木属,大约6-10种，悬 铃木属物种在分子方面的研究较为缺乏,数据库中 的基因数据有限,因此根本不存在基因数据很全的 近源物种,使得基因克隆难度大大增加.