DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
分子克隆技术的使用方法
分子克隆技术的使用方法分子克隆技术是在分子生物学领域中最常用的一种实验方法，它可以帮助研究人员复制并分离出特定的DNA序列，用于进一步研究和应用。
分子克隆技术的使用方法主要包括DNA提取、限制性内切酶切割、连接反应、转化和筛选等步骤。
下面将对这些步骤逐一进行介绍。
首先，DNA提取是分子克隆技术的第一步，它的目的是从样品（例如细菌、植物或动物组织）中提取出目标DNA。
提取方法主要有酚/氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。
在提取过程中，我们需要将样品细胞破裂，并通过使用蛋白酶分解蛋白质，最后通过乙酸盐、异丙醇等溶剂沉淀目标DNA。
其次，限制性内切酶是分子克隆技术中的关键工具，它能够识别并切割DNA 的特定序列。
在实验中，我们选择与目标DNA序列相匹配的限制性内切酶，将其与目标DNA一起反应，酶可以精确切割DNA链，产生特定的末端序列。
这样的切割可以生成需要的DNA片段用于后续的连接反应。
连接反应是分子克隆技术的核心步骤，通过该步骤可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来。
通常情况下，载体DNA是一种循环的DNA分子，如质粒或噬菌体。
在连接反应中，我们需要将目标DNA片段与已经经过限制性内切酶切割处理的载体DNA进行连接。
连接反应可以使用DNA连接酶和缓冲液，在适当的温度下进行反应。
连接反应的最终产物是重组载体，内含目标DNA的插入片段。
然后，转化是将重组载体导入到宿主细胞中的过程。
对于大多数分子克隆实验来说，大肠杆菌是最常见的宿主细胞。
在转化过程中，我们需要将重组载体与宿主细胞共同处理，使其能够进入细胞内。
转化方法主要有热激、电击和化学法等。
通过转化，重组载体可以复制并表达其携带的目标DNA片段。
最后，筛选是分子克隆技术中的关键步骤，它可以确定是否成功克隆了目标DNA片段。
筛选依赖于所克隆目标的特性和选择的标记方法。
常用的筛选方法包括酶切鉴定、PCR扩增、限制性酶切图谱分析以及DNA序列分析等。
这些方法可以帮助我们鉴定和验证克隆的目标DNA片段是否符合预期。
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
重组DNA技术
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
直接筛选 1. 根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 2. 根据营养需要进行筛选 3. 根据噬菌斑类型进行筛选 4. 蓝白斑选择 间接筛选 1. 核酸杂交法 2. PCR法 3. 免疫化学 4. 受体/配体的结合性质 5. Southwestern/Northwestern 6. DNA限制性内切酶图谱分析 7. DNA序列分析
胰岛素在大肠杆菌体内的表达
凝血因子VIII高表达载体的构建和及其原理
转基因动物和植物
克隆的基因不仅可以导入细菌或培养的 细胞，而且能转入动植物体内，整合到 基因组内，使其所有的细胞都带有特定 的外源基因，从而根本上改变其遗传特 性。转基因动物或转基因植物就是指在 其基因组内稳定地整合有外源基因、并 能遗传给后代的动物或植物。
蓝白筛选法图解
基因克隆的详细步骤
获得外源DNA序列和目的基因； 将目的基因与载体相连； 将重组体导入特定的宿主细胞； 目的基因序列克隆的筛选与鉴定。
获取目的基因的手段
人工合成 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆 载体中释放出来 反转录 PCR
目的基因与载体的连接
将外源序列或目的基因插入载体，主要 是靠DNA连接酶和其它工具酶的配合使 用。根据末端的性质，它们的连接方式 主要有三种：（1）载体和目的基因具有 相同的粘性末端；（2）载体和目的基因 均为平端；（3）载体和目的基因各有一 个粘性末端和一个平端。选择哪一种连 接方式主要取决于载体的性质（特别是 MCS的性质）和目的基因的来源。
基因技术
The PCR reaction
Denature 95ºC Extend Primers 72ºC Anneal Primers 45-68ºC
template Primers, dNTPs, Taq polymerase, Mg2+
What do we achieve by cycling temperature in the presence primers, dNTP, Taq polymerase?
ori
kmram2 P o LacZ
（三）.限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制酶是一种必不可少的工具酶，是进行 限制酶是一种必不可少的工具酶， DNA分子切割的特殊工具。因此它有“分子 分子切割的特殊工具。 分子切割的特殊工具 因此它有“ 剪刀” 分子手术刀”之称。 剪刀”或“分子手术刀”之称。 1、概念：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease ) 是指能专一地识别DNA分子 上特定的碱基序列并将DNA切断的内切酶。 2、识别序列的特点 (1)专一； (2)常由4—6个碱基组成； (3)具有回文序列(palindromic sequence)
基因工程 基本原理 及技术
基因克隆(gene cloning )：是指目的基因 基因克隆 与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体 细胞内进行复制、扩增（也包括目的基因 的无细胞扩增-PCR）的技术。 基因表达(gene expression)：是基因的转 基因表达 录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到 蛋白质的传递和实现。
Principle of PCR
DNA polymerase use single strand DNA as template to synthesize new DNA in vitro,(dNTP;Buffer;Mg2+,Primers) Chain reaction: Repeated cycles of reaction under the same condition.
DNA的克隆过程概述
DNA的克隆过程概述DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。
一目的DNA片段的获得DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。
由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DN A 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。
二载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。
2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。
同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。
3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。
4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。
若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。
DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。
基因克隆
基因克隆的方法基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义DNA段同能够自我复制的载DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA 技术。
根据这个定义，于是选择和使用不同的方法，最后得到含有目的基因片段的菌株。
针对目的基因的来源不同，可以选择多种克隆方法，但并没有放之四海而皆准的方法，要针对自己的目的基因的特点采取相应的且合适准确的方法来获得目的基因的克隆。
1当目的基因的序列完全已知时。
则可以根据文献上所查到的基因的注册序列号到相应的网上数据库去查找该基因的全序列结构信息，例如最常用的美国NCBI网站上的Genbank数据库。
然后查找到相应的目的基因的核苷酸序列信息和其来源。
然后使用生物信息学软件对基因的序列进行分析，设计通过PCR反应来扩增目的基因的核苷酸引物，并将设计的引物序列发给生物技术公司合成，最后得到引物核苷酸并用纯水进行合理的稀释。
接下来将采集含有目的基因的生物标本材料，使用合理的方法提取生物标本的基因组并进核酸浓度与纯度的测定，由于生物体的核酸从化学性质上来讲主要分为DNA和RNA两种，所以提取基因组后针对基因组的选择要尽可能去除另一种核酸的干扰与污染。
然后根据基因组的质量，浓度，PCR扩增设计引物的结构，目的基因的长度等因素设计PCR反应的条件，反复试验以找到能够通过PCR方法来准确扩增目的基因的最佳反应条件。
在目前的PCR反应中所采用工具酶为Taq DNA聚合酶，通常所用的Taq DNA聚合酶具有一个生物反应特性，在其扩增的PCR产物上，其3’末端总是会带有一个非模板依赖性的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A( dATP), 因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性，故可以针对这一点采取两种克隆策略。
其一，可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接；其二，可直接与一些T载体（切口处含有一个突出T碱基的克隆载体）连接并克隆。
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DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。
测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。
目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。
化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。
一般能读出200-250个核苷酸序列。
双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。
基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。
至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列分子克隆技术通常特指基因克隆（gene cloning）或DNA重组技术（recombinant DNA technology）。
基因克隆主要包括：①连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子，②将重组DNA分子转入受体细胞，使外源基因随受体细胞分裂而得以复制、繁殖。
一、基因克隆的基本方法一个典型的基因克隆实验，主要有以下操作和结果：（1）包括有目的基因在内的DNA片断插入另一个DNA分子（克隆载体，通常是环状的），形成重组DNA分子。
（2）重组DNA分子通过转化或其他类似的方法被导入受体细胞。
大肠杆菌是使用较多的受体细胞。
（3）在受体细胞中，克隆载体指导重组DNA分子复制，产生许多完全相同的拷贝。
（4）当受体细胞分裂时，重组DNA分子的拷贝进入子细胞，克隆载体的复制将在子细胞中继续。
（5）大量分裂的受体细胞形成克隆：一个细胞群体，其中每个细胞都含有许多重组DNA分子的拷贝。
显而易见，基因克隆是一个比较直观而简单的操作程序。
它之所以具有非常重要的生物学意义，是因为这一技术可以为我们提供一个纯粹的基因标本。
通常，一个基因总是和细胞里其他基因同在。
基因克隆技术诞生之前，我们根本无法纯化单个基因，这意味着我们只能对基因群、而不是特定基因的结构与功能进行研究和开发利用。
１、重组DNA分子的构建构建重组DNA分子是基因克隆实验的第一步，亦即，把环状的载体在指定部位切断，然后把含目的基因的DNA分子插入其中，再将两者连接起来。
这一过程需要两种DNA操作酶：限制性内切酶（restriction endonucleases）和连接酶（ligases）。
限制性内切酶能够识别DNA分子上的特定核苷酸序列，并在该处特异性切断DNA分子。
例如，Pvu I（细菌Proteus vulgaris分离）只识别和切断6核苷酸序列CGATCG；从相同细菌分离的Pvu II，却只识别并切断CAGCTG。
许多限制性内切酶的识别位点是6个核苷酸，但是，也有识别4个或5个、甚至8个核苷酸顺序的限制性内切酶。
此外，有些限制性内切酶的识别顺序可能不是唯一的，例如，Hinf I可以识别并切断GAATC、GATTC，GAGTC和GACTC。
因此，通常也将Hinf I的识别位点记为GANTC，N代表A、T、G和C中的任意一种核苷酸。
经限制性内切酶处理后的DNA分子断端有两种：平端和粘端，它们的性质对基因克隆的实验设计有重要影响。
其中，具有不同识别位点的限制性内切酶可以产生相同的粘端。
例如，Bgl II（AGATCT）和Bam HI （GGATCC）产生与Sau3A相同的GATC粘端。
显然，经上述三种酶处理的DNA分子片断之间均可以在相应的断端形成互补双链。
DNA分子片断通过粘端形成的碱基互补并不能使之相互连接，后一过程需要连接酶的催化作用。
所有生物细胞中都产生连接酶，但是，基因克隆中最常用的是T4噬菌体的连接酶。
连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键。
由于平端不能使DNA片断保持相互接近的位置，因而，和粘端相比，连接酶对平端DNA 分子之间连接反应的催化效率较差。
２、克隆载体及其主要功能载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。
质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。
目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。
质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb（通常，我们很难完整地分离和纯化长度超过50kb的DNA大分子）。
pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。
通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。
因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。
另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。
实际上，现在经常使用的许多质粒载体不同于pBR322，除抗生素抗性基因之外，这些质粒中的其他基因也可以作为选择基因。
例如，pUC8带有氨苄青霉素抗性基因和LacZ/基因。
由于目的基因的插入部位位于LacZ/基因之内，所以，甄别转化细胞的操作变得更加直观和简单。
质粒能使转化细胞在含有氨苄青霉素的培养基上生长，并且，如果同时添加LacZ/基因表达诱导物质IPTG和LacZ/酶（b-半乳糖苷酶）的底物X-gal，那么，带有目的基因的转化细胞菌落呈现蓝色，不含目的基因的转化细胞菌落呈现白色。
在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。
和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。
通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。
因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。
筛选带有目的基因的噬菌体的方法多种多样，例如，使用有LacZ/基因的噬菌体载体时，可以通过X-gal 培养基上形成噬菌斑的颜色，区别带有目的基因的重组噬菌体（重组子）和没有目的基因的载体。
有时，也可以简单地通过转导前后所形成的噬菌斑形态鉴别重组子。
和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。
例如，pBR322及pUC8的质粒中可以插入最长8kb的DNA片断，载体等噬菌体则能克隆长达25kb的DNA片断。
３、真核生物的克隆载体通常，大肠杆菌及其质粒或噬菌体载体可以充分满足分离和纯化某些实验用基因的目的。
但是，我们有时需要用真核生物细胞而不是大肠杆菌细胞作为受体，例如，利用基因克隆控制和促进重要代谢产物（胰岛素等）的合成、改变受体生物的特定性状（将抗虫特性导入粮食作物等），等等。
这时，我们必须选择适合于真核细胞的克隆载体。
酵母是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，培养酵母菌和培养大肠杆菌一样方便。
酵母克隆载体的种类也很多。
其中，游离型质粒YEps（yeast episomal plasmids）、整合型载体YIps（Integrative yeast vectors）和人工染色体YACs（yeast artificial chromosomes）是三种最具代表性的酵母克隆载体。
YEps是一种罕见的真核细胞质粒，大小2mm、长约6kb。
YEps在细胞内的拷贝数为70-200个。
YEps 的性质和细菌质粒载体非常相似，唯一不同的是转化细胞的筛选方法。
使用YEps时，主要通过受体细胞营养要求的变化鉴别转化细胞与受体细胞。
由于利用YEps克隆的基因容易在细胞继代过程中丢失，因而，人们常用YIps替代YEps。
不过，作为酵母菌的克隆载体，YIps的转化频率很低。
另一方面，典型的YACs 包括一个着丝点、两个端粒、一个复制起点和几个选择标记基因，是一个微型染色体。