PVDF转膜实验步骤及注意事项
Western blot操作步骤及技巧
Western blot操作步骤及技巧实验器材：电泳及转膜设备、PVDF膜（0.2μM）实验试剂：SDS凝胶配制试剂盒（碧云天）、SDS电泳缓冲液、转膜液（分干转及湿转）、蛋白Loading buffer、预染蛋白Marker、甲醇、PBST/TBST、脱脂奶粉、一抗抗体、二抗抗体、碱性磷酸酶显影液或ECL化学发光显影液、BSA、PMSF、细胞蛋白裂解液实验步骤：一、配胶（具体浓度选择根据所需检测蛋白分子量大小而定，常用10%）1.将玻璃板洗净、用ddH2O冲洗、晾干；2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（AP及TEMED使用前加入），避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡；3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，可以使用ddH2O或者异丙醇封胶，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用ddH2O冲洗干净;4.灌好浓缩胶插入梳子，待胶凝固拔除梳子。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
二、样品处理1.悬浮细胞：a) 1.5 ml EP管或离心管收集细胞，2000rpm、3min去培养液后用温的PBS洗1遍；b)离心尽量去除PBS，加入适量细胞裂解液（裂解液使用前按100-200：1加入PMSF），冰上裂解30min,期间不间断振荡EP管，使细胞裂解充分；c)4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；2.贴壁细胞：a)去培养液后用温的PBS冲洗1遍，尽量去除残留PBS；b)加入适量的冰预冷的裂解液（6孔板细胞密度在80%左右，每孔加100-200μl裂解液,浓度在2-4μg/μl左右）后置于冰上30min，期间不断震荡培养板，使裂解充分；c)收集细胞裂解液在EP管后4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；3.组织：a)匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
基因的功能实验报告
一、实验目的通过本实验，了解基因的功能，掌握基因表达调控的基本原理和方法，验证基因对生物性状的控制作用。
二、实验原理基因是生物遗传信息的载体，通过转录和翻译过程表达成蛋白质，进而调控生物的性状。
基因表达调控是指生物体内基因在特定时空条件下，通过多种机制实现对基因表达的控制。
本实验以大肠杆菌为实验材料，通过构建基因表达载体，观察基因表达对生物性状的影响，验证基因的功能。
三、实验材料1. 大肠杆菌菌株：E. coli DH5α、E. coli BL212. 基因表达载体：pET-28a3. 酶切试剂：HindIII、EcoRI、T4 DNA连接酶4. 限制性内切酶缓冲液5. DNA标记物：DL2000 DNA Marker6. 载体质粒提取试剂盒7. DNA纯化试剂盒8. 转化试剂：CaCl29. LB液体培养基、LB固体培养基10. 1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）11. 1mol/L EDTA-Na2缓冲液（pH 8.0）12. 5mol/L KCl13. 10mg/mL 溶菌酶14. 1mol/L 醋酸铵15. 5% 碘化钾16. 2% 硫酸铜17. 1% 氯化钠18. 1% 氢氧化钠19. 10% 磷酸氢二钠20. 水浴锅、PCR仪、凝胶成像仪、离心机、超净工作台等四、实验方法1. 基因克隆（1）设计引物：根据目的基因序列，设计一对引物，用于扩增目的基因。
（2）PCR扩增：以大肠杆菌基因组DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增。
（3）酶切、连接：将PCR产物与载体质粒进行HindIII和EcoRI酶切，连接成重组质粒。
（4）转化：将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α菌株中。
（5）筛选：通过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆。
2. 基因表达（1）制备感受态细胞：将阳性克隆菌液与CaCl2混合，制备感受态细胞。
（2）转化：将重组质粒转化到感受态细胞中。
（3）筛选：通过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆。
western_blot
设立对照样品 为了验证凝胶电泳及转膜正常进行，检测样品应同时与阴性对照和阳性对照同时进 行凝胶电泳和转膜。
膜的选择 常用的转移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纤维素膜。PVDF 膜与目的蛋白的结合能力高，灵敏度高，不易破碎，同时也适用于再次标记 (Reprobing)（PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中仪增加膜的亲水性）。而硝酸纤维素 膜虽不需要浸泡但极易破碎。
-1-
③ 封闭前的注意事项
膜标记好正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用有色分子量Marker或转膜后可在 膜上稍微剪断一个角（可自由决定剪断方向）。
封闭剂的选择 有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果。另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及 标记抗体的酶活性，应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂。
目的蛋白质量较差
IB RD 增加蛋白电泳量。
抗体量不充分 标记抗体失活
IB RD
有可能目的蛋白对应的抗体亲和性较弱。提高抗体浓度。 抗体活性有可能下降。Dot blot试验确定抗体活性。
使用不含有叠氮化钠的抗体。叠氮化钠阻碍HRP活性。
发光底物劣化
调查底物活性。可以少量调制working solution，暗室内加入少量HRP标识抗体观察是否有蓝光出 现。如果没有蓝光出现，说明底物或HRP标识抗体已经劣化。 注意装有试剂的瓶子不要出现污染。保存的底物试剂与其他试剂混合，也有可能导致底物劣化。
① 电泳前的注意事项
凝胶的选择 如果已知目的蛋白的分子量，选择的分离胶浓度应使蛋白质的迁移位置在中央。如 果是未知分子量的蛋白质样品，使用梯度凝胶。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
WB快速转膜液的使用方法及步骤
WB快速转膜液的使用方法及步骤NcmBlot Rapid Transfer Buffer 快速转膜液是新赛美生物研发的一种高达20 倍浓度的高效转膜液，用于Western Blot 湿转法转膜，能高效快速地将蛋白转移到印迹膜（PVDF或硝纤膜）上。
不使用甲醇，能在15-30 分钟内完成转膜过程。
操作步骤
1 1：：1X 快速转膜液的配制（1000 ml）：取50 ml 快速转膜液（20X）+850 ml 去离
子水+100 ml 无水乙醇
2 2 ：做好转印三明治结构，然后转移至电泳槽中，设定恒流400 mA，电泳时间25-30
分钟完成蛋白转膜。
注意：PVDF 膜使用前要用无水甲醇润湿0 30 秒以上。
转印电流建议设定恒流, 400mA, 一般0 25-30 分钟可以将D 150kD 以下蛋白完全转印；小于D 100kD 蛋白0 20 分钟即可完全转印；对于大于D 150kD 蛋白，建议延长0 5-10 分钟。
凝胶的浓度影响转印的效率，对于胶浓度7.5%,20 分钟即可完成转印；对于胶浓度10%,25-30 分钟即可完成转印；对于胶浓度大于10%, 建议延长0 5-10 分钟
(4)40 分钟时间内转膜不需要放冰上，转膜槽内外都不可放冰预冷，否则会影响效率。
N端测序转膜
·蛋白N端测序转膜电泳转膜时有两点需要特别注意：1）转膜时的缓冲液不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，会对测序造成污染，推荐使用CAPS 缓冲液，配方如下：CAPS buffer, 1X (10 mM CAPS, pH 11.0, 1 liter) ：CAPS[3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid] 2.2g .Dissolve in 600 ml distilled water. Adjust to pH 11.0 with NaOH. Adjust volume to 1.0 liter.· 2）PVDF膜染色时不能使用考马斯亮蓝G250，推荐使用丽春红染色，也可使用考马斯亮蓝R250·转膜方法大致如下：1）蛋白质的SDS-PAGE电泳：上样20-50ug，尺寸为7cm*5cm凝胶，12.5%胶浓度（根据蛋白大小调整），加预染marker，上样量10ul。
2）电泳结束后，将凝胶中需要转膜的部分切下，用milli-Q水清洗两次，然后用转移缓冲液（CAPS buffer：10mM CAPS，10%甲醇，pH11）平衡5分钟。
3）准备PVDF膜，剪成和胶一样大小，在100%甲醇中均匀润湿（约2-3秒），再在水中漂洗2-3分钟，然后在转移缓冲液中平衡至少15分钟。
4）将凝胶置于也在转移缓冲液中浸润的厚滤纸上，然后将PVDF膜覆于凝胶上，再盖上一张浸润的厚滤纸（避免在每一层间留有气泡），最后将他们一起夹入电转移槽中5）注意：凝胶在负极端（黑色电极），PVDF膜在正极端（红色电极），加入大约1L 的电泳缓冲液，打开外循环制冷至10度，并打开电转仪槽下的磁力搅拌器，调节至搅拌子低速运转。
6）打开电源，一般设置为250mA，1hour（如果目标蛋白质分子量小于20KD，设置为180mA，1 hour；如果全胶转膜则150mA，2hour）。
半干转膜方法
半干转膜方法
半干转膜方法是一种常用的Western blotting 技术，主要步骤如下：1. 组装转移叠层：
- 用蒸馏水清洗电极。
- 在缓冲液中平衡凝胶。
- 剪裁印迹纸和转移膜，应与胶体同等尺寸。
如果膜需要比胶更大，使用聚脂薄膜面罩。
- 准备印迹纸：每个胶，至少剪裁6张与胶差不多同等大小的印迹纸。
根据所需缓冲液的用量测量印迹纸层的厚度和数目。
用转移缓冲液浸泡至少3张印迹纸。
一张张放于下电极，除气泡。
- 准备膜：对于每个胶，剪裁1个与胶同等大小或稍小一点的膜。
用蒸馏水提前润湿硝化纤维膜或者尼龙膜。
用甲醇提前润湿PVDF 或者其他疏水膜。
然后将膜浸润在转移缓冲液中2-5分钟。
2. 完成叠层：
- 将预先润湿的膜放置在印迹纸上。
- 将胶放置在膜上。
- 用浸润过的三层印迹纸覆盖在胶上。
- 进行电转移。
请注意，在进行半干转膜时，需要严格遵守实验步骤和操作规范，以确保实验结果的准确性和可靠性。
如果你对具体的实验细节或操作步骤有疑问，建议咨询相关专业人士或查阅相关实验手册。
蛋白印记(WB详解)之兰大版
之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离
时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使 胶不均匀。
蛋白分子的电荷差异，因此电泳中蛋白亚基的迁移率取
决于亚基分子量的大小，这样蛋白本身的电荷因素就可 以被忽略。
抗体反应前为什么需要先进行封闭
封闭：用大分子覆盖非相关的蛋白位点，降低
非特异性结合背景。
封闭液：TBST配的5%的脱脂奶粉，室温1-2小
时。
内参及其作用
内参：一般是指由管家基因编码表达的蛋白，
海绵 + -
凝胶
电极
滤纸
Gel浓度 不同浓度分离胶区分度
5% 10%
200 97 66 45 200 97 66
15%
200 97 66
45
29
29 45 29
样品处理时为什么加上样缓冲液
上样缓冲液成分：二硫苏糖醇DDT、十二烷基硫酸钠
SDS、电泳指示剂溴酚蓝、甘油；
蛋白质样品中加SDS和强还原剂后蛋白质分子被解聚， 解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋 白质SDS体，所带电荷大大超过了蛋白质分子原有带电 荷量，好比蛋白分子穿上了带负电的外衣，消除了不同
它们在各组织细胞中表达相对恒定，在检测蛋
白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作
用是校正蛋白定量减少上样过程中存在的实验 误差，保证实验结果的准确性。
细胞培养后细胞蛋白没有提出来的解决方法
1、吸取50ul离心后的细胞再加50ul一倍的上
蛋白量289kd转膜
蛋白量289kd转膜1.引言1.1 概述概述部分内容：在生物学研究中，蛋白质是一种极为重要的生物大分子，扮演着多种生物学功能的角色。
为了进一步探究蛋白质的结构和功能，科学家们经常需要将蛋白质从一个环境转移到另一个环境中。
而转膜技术则是一种常用的实验方法，用于将蛋白质从一种液相体系转移到固相或者膜相体系中。
本文将重点介绍一种蛋白转膜方法，即蛋白量为289kd的转膜技术。
通过这种方法，我们可以将具有289kd蛋白质的溶液从一个容器转移到另一个容器中，以实现对蛋白质的分离、纯化、检测等一系列操作。
首先，我们将介绍转膜技术的原理和操作步骤。
然后，我们将详细介绍如何在实验室中进行蛋白质转膜实验，包括所需材料和仪器设备的准备，操作的步骤和注意事项等。
除此之外，我们还将探讨蛋白质转膜技术的应用领域和前景。
随着生物科技的不断发展，蛋白质转膜技术在基础研究、药物开发、生物工程等领域中的应用越来越广泛。
我们将展望蛋白质转膜技术在未来的发展方向，并提出一些可能的改进和优化方案。
总之，本文将全面介绍蛋白量为289kd的转膜技术，旨在帮助读者了解和掌握这一实验方法，同时展望它的潜在应用和未来发展方向。
希望本文对相关领域的科研工作者和对蛋白质研究感兴趣的读者有所帮助。
1.2文章结构文章结构指的是整篇文章的组织结构和章节安排。
通过合理的结构安排，可以使文章内容更加清晰、有条理，方便读者理解和阅读。
本文按照以下结构进行组织：2.正文:2.1 第一个要点:- 2.1.1 蛋白质转膜的定义和原理：介绍蛋白质转膜的基本概念，并解释其所依据的原理和机制。
- 2.1.2 蛋白质转膜的重要性：阐述蛋白质转膜在生物学研究中的重要作用，以及其在医学和生物技术领域的应用前景。
- 2.1.3 蛋白质转膜的方法和技术：介绍常用的蛋白质转膜方法和技术，如膜电泳、离心过滤和电渗析等，并分析它们的优劣和适用范围。
2.2 第二个要点:- 2.2.1 蛋白质转膜实验步骤：详细描述蛋白质转膜实验的具体步骤，包括样品准备、膜和膜缓冲液的选择、转膜装置的使用等。
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蛋白质转膜实验注意事项（用于N端测序）
转膜实验操作要点
1、SDS－PAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统:用于>=20KD蛋白；Tris－Tricine系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）；
2、甲醇浓度：CAPS电印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20％（甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）；
3、PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。
（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。
如果膜变干，须重复本步骤的操作）；
4、凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。
（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤）；
5、安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中；
6、转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。
（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。
例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）；
7、PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色；
8、膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸中）30-50秒（切勿超过1分钟），50％甲醇脱色（勤换脱色液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可；
转膜实验注意事项
1）电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量；
2）预电泳处理：低电流跑空胶2～2.5小时，防止胶内杂质污染；
3）转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液；
4）转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜；
5）染料选择：不能使用考马斯亮蓝G250，推荐使用丽春红，或者考马斯亮蓝R250；
6）转印效果：避免条带拖尾，用于测序的PVDF膜上条带应狭窄清晰；
7）脱色过程：乙醇可增加到40－60％，背景颜色很快脱掉后，纯净水漂洗，滤纸上晾干；8）膜保存：膜请夹在滤纸间装于自封袋中，冰箱内可以放置3～6个月；
9）10×CAPS（100mmol/L）缓冲液配制，方法如下：
CAPS，22.13g；加去离子水至900ml；用2mol/L NaOH （约20ml）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4ºC。
CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）配制，方法如下：
10×CAPS 200ml；加入甲醇200ml；加入去离子水1600ml即可。