实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色
荧光染色观察实验报告
荧光染色观察实验报告实验目的：观察荧光染色在生物样品中的应用，了解荧光染色的原理以及其在显微镜下的观察效果。
实验原理：荧光染色是利用荧光标记物与样本中的目标分子发生特异性结合来实现对目标分子的检测。
在该实验中，我们选取了一种常用的荧光染色剂——荧光素腺苷酸（Fluorescein Phosphoramidite, FAM）作为荧光标记物。
荧光素腺苷酸在体系中将与目标分子发生共价结合，并在激发光的照射下，发出独特的荧光信号。
实验步骤：1. 洗涤载玻片：将载玻片置于洗涤液中，如去离子水中，轻轻移动片子使之均匀受液浸润，然后将其取出放在纸巾上晾干。
2. 准备标本：取一小块细胞组织或细胞液，均匀涂抹在已经晾干的玻片上。
3. 固定样品：将玻片连续沉浸于冰冷的乙醇/醚混合溶液中，静置5-10分钟，然后将其自然晾干。
4. 涂抹荧光素腺苷酸：将0.2%荧光素腺苷酸溶液均匀地滴在玻片上，使其完全覆盖样品，然后将其在黑暗条件下孵育10分钟。
5. 洗涤载玻片：将载玻片再次焯洗于去离子水中，冲洗半分钟，使荧光素腺苷酸不结合的部分被洗去。
6. 制备荧光显微镜片：利用玻片夹轻轻将载玻片与另一块干净的玻片夹紧，并将两片之间多余的液体抹去。
7. 观察荧光信号：将制备好的荧光显微镜片放入荧光显微镜仪器中，利用激光或特定波长的光源照射样品，并通过目镜或摄像机观察样品显现的荧光信号。
实验结果：在荧光显微镜下观察，使用荧光素腺苷酸染色的细胞组织或细胞液会发出明亮的绿色荧光信号。
这种信号可以使样品中的目标分子在背景中清晰可见，从而方便我们对细胞结构和组成进行观察和研究。
实验讨论：荧光染色技术广泛应用于生物学研究领域，其应用范围包括但不限于细胞核酸和蛋白质的检测、细胞内代谢和信号通路的研究等。
荧光染色的优势在于其高灵敏度、高特异性、无需肉眼观察等特点。
在观察荧光信号时，需注意荧光素腺苷酸的浓度和染色时间的选择，避免信号过强或过弱，影响观察结果的准确性。
荧光显微镜的基本原理及应用
六、荧光组化实验中应注意的几个问题
1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。 当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因 此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。 2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常 出现温度猝灭。 3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰 竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进 行观察，需照相时再适当增强激发光。 4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一， 也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的 浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由 于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号传 导中信号分子的迁移功能，将 一荧光蛋白与信号分子相偶联， 根据荧光蛋白的分布情况即可 推断信号分子的迁移状况，并 推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
八、使用注意事项
1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。
(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。
(3)插入挡光板，中断光路。
七、荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离 的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的 技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连 接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接 免疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。 用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体 复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent technique)”。
荧光显微镜的使用流程
荧光显微镜的使用流程一、介绍在生物科学领域中，荧光显微镜是一种常用的工具。
它利用荧光现象来观察和研究细胞、组织和生物分子。
本文将介绍荧光显微镜的使用流程，包括前期准备、显微镜的操作步骤、关键技巧和常见问题解答。
二、前期准备在使用荧光显微镜之前，需要进行一些前期准备工作，以确保顺利进行观察和实验。
2.1 样本准备首先，需要准备好要观察的样本。
样本可以是细胞、组织切片或荧光标记的蛋白质等。
对于细胞样本，可以在培养皿中直接观察或使用刀片将其固定在载玻片上。
对于组织切片，需要进行固定、切片和染色等处理。
2.2 荧光染色荧光显微镜通过荧光标记物来观察样本。
因此，在观察前需要对样本进行荧光染色。
常用的荧光染料有荧光素、荧光素二异硫氰酸酯（FITC）等。
根据需要选择适当的染料，并根据染料的使用说明进行染色操作。
2.3 防护措施在进行荧光显微镜观察时，应注意个人防护。
戴上实验手套和口罩，避免接触染料和其他有害物质。
同时，确保显微镜和工作台的清洁，以避免样本污染和数据误差。
三、荧光显微镜的操作步骤荧光显微镜的操作步骤通常包括调节显微镜参数、调节荧光镜片和观察样本等。
3.1 调节显微镜参数在使用荧光显微镜前，需要调节显微镜的参数。
首先，打开显微镜，并调节光源亮度合适。
然后，调节物镜，使样本图像清晰可见。
最后，根据需要选择合适的荧光滤光片，并将其插入显微镜中。
3.2 调节荧光镜片荧光镜片是荧光显微镜中一个重要的部件。
在观察时，需要根据染料的特性来选择合适的荧光镜片。
常用的荧光镜片有单色荧光镜片、双色荧光镜片和三色荧光镜片等。
调节荧光镜片可以增强荧光信号和减少背景噪音。
3.3 观察样本当显微镜参数和荧光镜片设置好后，可以开始观察样本。
将染色好的样本放置在载玻片上，并用夹片封闭。
然后，将载玻片放置在显微镜的样本台上，并通过调节焦距和聚焦仪调整样本的焦平面。
最后，通过目镜观察样本，并使用涂片或液晶板记录图像。
四、关键技巧使用荧光显微镜的过程中，有一些关键技巧可以帮助提高观察效果和数据质量。
实验五 实验五 叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离与荧光观察一．实验目的1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二．实验原理1、叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心差速离心，是分离细胞器的常用方差速离心法。
2、一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
3、依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化氢酶体、沉降顺序为：沉降顺序为细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化氢酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。
内质网与高尔基体、核蛋白体。
4、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L 氯化钠或 0.4 mol／L 蔗糖溶液) 中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在 1000 r／min 的条件下离心 2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）5、在 3000 r／min 的条件下离心 5min，分离过程最好在 0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
三．实验仪器1、器材：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、500ml 烧杯 2 个，2 、器材：250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
3、材料：新鲜菠菜。
4、试剂：0.35 mol／L 氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。
四．实验方法1．选取新鲜的嫩菠菜叶，去除叶梗及粗脉，称40g于150ml0.35mol／L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。
2．利用组织捣碎机低速(5 000 r／min)匀浆 3~5min。
荧光显微镜实验报告
荧光显微镜实验报告实验报告名称：荧光显微镜实验一、实验目的本实验旨在让学生了解并掌握荧光显微镜的基本原理、操作方法及其在生物学研究中的应用。
通过观察荧光染色标本，学生将了解荧光显微镜在生物医学研究中的重要作用。
二、实验原理荧光显微镜是一种利用激发的荧光物质发出特定波长的光，经过滤片后形成可见的荧光图像的显微镜。
荧光显微镜一般由光源、滤片、激发滤片、发射滤片、显微镜主体等部分组成。
在荧光显微镜中，标本首先被特定波长的紫外线或蓝紫光激发，这些光线能够激发标本中的荧光物质，使其发出波长更长的可见光。
这些可见光经过一系列的滤片和反射镜后，最终投影到显微镜的观察目镜上，形成荧光图像。
荧光显微镜在生物学研究中具有广泛的应用，例如观察细胞结构、染色体分析、基因表达研究等。
通过荧光染色技术，可以增强标本的荧光信号，提高观察的灵敏度和分辨率。
三、实验步骤1.准备阶段（1）检查仪器设备是否正常运转，确保电源线、数据线和光源等无损坏。
（2）准备所需试剂和标本，如荧光染料、抗体、细胞培养液等。
（3）根据需要选择合适的滤片和荧光显微镜的工作模式（如明场、暗场等）。
2.实验操作阶段（1）将荧光染料加入标本中，使标本充分染色。
染色时间根据荧光染料的特性和需要而定。
（2）将染色的标本放在荧光显微镜的载物台上，确保标本位置准确。
（3）打开荧光显微镜的电源，调整光源亮度，选择合适的滤片组合，启动荧光显微镜的工作模式。
（4）通过观察目镜观察荧光图像，调整焦距和视野位置，记录观察结果。
3.数据处理与分析阶段（1）记录观察到的荧光图像，包括图像特征、颜色、亮度等信息。
（2）对荧光图像进行定量分析，如测量荧光信号的强度、面积、形状等参数。
（3）根据实验目的进行数据分析，比较不同处理组与对照组之间的差异。
四、实验结果与数据分析本次实验中，我们观察了荧光染色的人口腔上皮细胞（HOEC）。
细胞经过荧光染色后，呈现出明显的荧光信号。
通过记录荧光信号的特征和形态学参数，我们发现实验组和对照组之间存在显著差异。
细胞生物学荧光染色实验
二、实验原理
荧光显微技术是利用短波光照射被射物质，以激发其发射荧光而 在荧光显微镜下可以检视的方法。 荧光又可分为：自发荧光和次生荧光。自发荧光是指有些生物体 受到短波光照射后，直接发出的荧光。如经紫外光照射后，叶绿体 发出的红色荧光；木质素发出的黄色荧光等。次生荧光是指有些生 物材料受到短波光照射后并不发光，但当它吸附荧光染料后，也同 样产生荧光，这种荧光也称间接荧光。
三、实验用品
(一) 材料：新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆原生质体悬液，人口腔上皮细 胞。 (二) 用品：荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，烧杯，牙签等。 (三) 试剂： 1．二丙酸酯荧光素溶液：取l0mg二丙酸荧光素于5ml丙酮中，将 此溶液逐滴加入 5ml PH5-6生理盐水或0.65M的甘露醇溶液中，直到 出现永久性乳白沉淀为止。 2．0.01％吖啶橙的生理盐水溶液。
(一)利用荧光增白剂观察植物细胞壁 植物细胞壁有强烈的吸附染料的能力，因此很 多荧光染料都能着染细胞壁，但近年来最常用的还 是荧光增白剂，以此来鉴别细胞壁的状况，并常用 于检查原生质体细胞壁是否分解完全，以及原生质 体再生细胞壁的鉴别。
1．取洋葱表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以 荧光增白剂染色5分钟，加盖玻片，荧光显微 镜下观察其细胞壁。 2．取以酶液游离出来的原生质体悬液l滴于 载玻片上，加荧光增白剂一滴，染色 5分钟，加
五、荧光的细胞化学测定
单成彬制作
一、实验目的
学习荧光显微镜的使用，了解荧光 显微技术原理和方法，以及荧光技术在 细胞化学方面的应用。
二、实验原理
荧ห้องสมุดไป่ตู้显微技术是利用短波光照射被射物质，以激发其发射荧光而 在荧光显微镜下可以检视的方法。 荧光又可分为：自发荧光和次生荧光。自发荧光是指有些生物体 受到短波光照射后，直接发出的荧光。如经紫外光照射后，叶绿体 发出的红色荧光；木质素发出的黄色荧光等。次生荧光是指有些生 物材料受到短波光照射后并不发光，但当它吸附荧光染料后，也同 样产生荧光，这种荧光也称间接荧光。
细胞生物学实验材料
实验一荧光显微镜的原理和使用实验二叶绿体的分离与荧光观察实验三线粒体的活体染色与观察实验四细胞膜的通透性实验五 DNA的细胞化学——Feulgen反应实验六植物染色体标本的制备和观察实验七细胞计数实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察实验九植物原生质体的分离和活性鉴定实验十环境因素诱变染色体改组的观察实验一荧光显微镜的原理和使用一、实验目的了解荧光显微镜的构造及其维护方法；掌握荧光显微镜的使用方法和使用中的注意事项。
二、实验原理荧光显微镜是选择由高压汞灯或类似光源发出一定波长的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，观察细胞某种特异成分的分布状态的显微镜。
与普通光学显微镜一样，荧光显微镜也有物镜、目镜、调焦装置、光源、聚光器、载物台、镜身等组成部分。
所不同的是，荧光显微镜增加了激发光源和滤片系统，它投射到样品上的是特定波长的激发光而不是普通的可见光。
在激发光的作用下，样品中的荧光物质产生图1荧光显微镜发射光（即荧光）。
因此，荧光显微镜观察到的是样品中能产生荧光的部分所呈现的荧光映象，普通光学显微镜则是整个样品的可见光透射和折射影像。
某些物质在—定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。
三、实验用品荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸馏水、水葫芦叶片四、实验内容与方法（一）荧光显微镜的构造1、基本装置荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。
荧光显微镜的使用流程
荧光显微镜的使用流程一、前言荧光显微镜是一种高端的显微镜，广泛应用于生物学、医学等领域。
本文将详细介绍荧光显微镜的使用流程，包括准备工作、样品制备、仪器操作等方面。
二、准备工作1.检查仪器：首先要检查荧光显微镜是否正常工作。
确认灯泡是否亮着，光源是否正常，调整好滤镜等。
2.清洁仪器：使用前要清洁荧光显微镜，以确保样品不会受到污染。
可以用纯净水和酒精擦拭仪器表面和物镜。
3.调节目视系统：荧光显微镜的目视系统需要进行调节。
首先要调节目视系统的放大倍数和对焦，以便更好地观察样品。
三、样品制备1.选择适当的标记物：根据实验需求选择适当的标记物。
比如选择与待测蛋白质结合能力较强的荧光染料。
2.固定样品：将待测样品固定在载玻片上，并进行脱水处理。
可以在载玻片上加一滴PBS缓冲液，然后用吸水纸吸干，再滴上荧光染料。
3.封片：将载玻片和盖玻片封起来，以防止样品受到外界污染。
四、仪器操作1.调节荧光显微镜：首先要调节荧光显微镜的亮度和对比度。
可以通过调节荧光显微镜的滤镜来选择合适的波长。
2.选择放大倍数：根据需要选择合适的放大倍数。
一般情况下，使用40-100倍的物镜进行观察。
3.观察样品：将载玻片放在样品台上，并用目视系统进行对焦。
观察样品时要注意避免强光照射，以免影响荧光信号。
4.拍照记录：可以使用相机或者电脑软件对观察到的图像进行拍照记录。
五、数据分析1.图像处理：使用图像处理软件对拍摄到的图像进行处理，以增强对比度和清晰度。
可以使用Photoshop等软件进行处理。
2.数据统计：根据实验需求对数据进行统计分析，并得出结论。
六、注意事项1.避免强光照射：荧光显微镜对强光非常敏感，避免强光照射可以减少样品的损伤。
2.注意样品制备：样品制备过程中要注意防止样品受到污染，以保证实验结果的准确性。
3.仪器维护：荧光显微镜是一种高端仪器，需要定期进行维护和保养，以确保其正常工作。
七、结论本文详细介绍了荧光显微镜的使用流程，包括准备工作、样品制备、仪器操作等方面。
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实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色
【实验目的】
掌握荧光显微镜的原理和使用；
掌握生物材料荧光染色的原理和应用。
【实验原理】
吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。
其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。
在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。
吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。
【实验用品】
1、器材
荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。
2、试剂
（1）0.1mol/l pH7.0 PBS液
A液：NaH2PO4·H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml；
B液：Na2HPO4·7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml；
取A液16.5ml＋B液33.5ml＋NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。
（2）1%吖啶橙原液
取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍）。
3、材料
口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。
【方法与步骤】
（1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。
（2）95%乙醇溶液固定5min。
（3）滴加0.01%吖啶橙染液5min。
（4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。
【结果与观察】
荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
【注意事项】
（1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。
（2）每种荧光染料，均有自己的最适pH，此时荧光最强。
当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。