贴壁细胞的免疫荧光染色方法

贴壁细胞的免疫荧光染色方法

Materials:

1. PBS solution

2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative):

Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃to dissolve;

3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution)

4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution)

5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot;

6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual

Procedure:

1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate;

2. Remove medium, rinse with PBS twice;

3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes;

4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time;

5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4?C for 10 minutes;

6. Remove PBS-T solution, rinse cells with PBS for 5 minutes at room temperature;

7. Block non-specific interaction with PBS-B solution at 37?C for 30 minutes;

8. Add primary antibody solution, incubate at 4?C overnight;

9. Remove primary antibody solution, wash with PBS for 5 minutes;

10. Add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1 hour;

11. Wash with PBS three times, 5 minutes each;

12. Add anti-fade DAPI solution if needed;

13. Observation.

细胞免疫荧光步骤

1.细胞爬片；

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；

3.PBS漂洗5min；

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；

5.PBS漂洗2次，每次5min；

6.1%BSA封闭30min；

7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；

8.PBS漂洗2次，每次5min；

9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；

10.PBS漂洗2次，每次5min；

11.5ug/ml DAPI染色2min；

12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:

2.5% DABCO (w/v)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

作为荧光显微镜使用：

（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。

（2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。（3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。

（4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。

作为荧光显微镜使用：

（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。

（2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。

（3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。

（4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。

细胞免疫荧光

细胞爬片

4%多聚甲醛固定10min

(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)

PBS漂洗5min

0.5% Triton 穿孔15min

(丙酮固定法不用透化处理)

PBS漂洗2次，每次5min

1%BSA封闭30min

加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h

PBS漂洗2次，每次5min

加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h

PBS漂洗2次，每次5min

5ug/ml DAPI染色2min

抗淬灭封片剂封片

2.5% DABCO (w/v)

抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

0.25g DABCO

9ml甘油

0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存

0.5ml ddH2O

2005-07-25 20:25

免疫荧光第一步的步骤几注意事项

1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.

2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元

前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.

4. 不知道你的一抗是在胞浆表达还是在胞核表达

如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟

5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.

6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.

7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.

注意,PBS液的PH值要调在7.4左右

孵育一抗不能干片,孵育一抗时间要久;其四,多余的封闭液不能洗掉,只能甩干