贴壁细胞的免疫荧光染色方法
免疫荧光技术实验步骤及方法
免疫荧光技术实验步骤及方法免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
10个关键点免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。
除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。
1、选择合适的细胞种板密度细胞数过多时，生长过密，细胞结构不清，易导致染色背景深，细胞数过少时，会使贴壁贴壁不佳，状态不好，一般以六孔板为例，（1-5）×100000比较适宜。
2、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。
现在固定液选择比较多，有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液（1：1），但效果最好的应用最多的还是推荐4%多聚甲醛。
之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。
前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。
使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。
另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。
3、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。
在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。
使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。
4、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。
但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。
如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
5、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。
细胞免疫荧光染色的自我总结
免疫荧光实验所需试剂1、PBS和PBST（0.05% Tween 20 in PBS：2000mlPBS+1ml吐温）2、4％多聚甲醛/PBS(4g多聚甲醛+50-80mlPBS+加热至60℃并搅拌+滴加少量1mol/L 的NaOH溶液使其变清亮，定容至100ml)3、0.1％ triton X-100/PBS配制（999mlPBS+1ml Triton X-100/曲拉通X-100（碧云天ST795），因为Triton X-100很粘稠，需减掉枪头尖慢吸）4、2％二抗同源血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致(中杉金桥封闭用正常羊血清工作液 ZLI9022)5、二抗（中杉金桥 594标记山羊抗兔IgG ZF0616）（中杉金桥 488标记山羊抗小鼠IgG ZF0512）细胞爬片的免疫荧光染色步骤：1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片[悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片]的六孔板或十二孔板中。
2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。
3）用新鲜配制4％多聚甲醛[4℃]固定细胞10分钟。
4）PBS洗三遍，每次5分钟。
5）用0.1％ triton X-100[PBS配制]对细胞透化处理10分钟。
6）加PBS，使液面覆盖玻片。
如果细胞贴壁好，PBS洗时可轻摇孔板洗三遍，每次5分钟[不必一直摇]。
如果细胞贴壁不好就不必了，可以考虑多加点PBS，或者每次浸泡时间稍延长1-2分钟。
7）2％二抗同源血清[购买的纯的羊或牛血清用PBS稀释至2%，当前用的是羊血清]封闭30分钟-60分钟，PBS简单冲洗两遍或者不洗。
8）染色前根据公司说明书建议的浓度配好1抗（1抗稀释液购自中杉金桥）[建议先测试抗体浓度，可依据公司推荐的浓度增加和减低浓度进行测试；如公司推荐1：200，可将抗体配成1：50、1：100、1：200、1：400、1：600，以不同浓度进行孵育，如果抗体有效，应当在有效染色的抗体浓度范围内都可染色，只是颜色深浅不同]，加入1抗，4℃冰箱孵育，一般要大于18小时[有的抗体可能需要多达50小时]。
免疫荧光染色
荧光免疫染色和DAPI染色实验1．实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。
实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。
利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。
二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。
另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。
DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。
结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。
Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。
后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。
本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。
免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。
细胞免疫荧光标准操作流程
细胞免疫荧光标准操作流程
细胞免疫荧光细胞免疫荧光标准操作流程标准操作流程
20×20盖玻片清洗干净后，无水乙醇浸泡过夜，载玻片置于无水乙醇中浸泡，待用；
1. 爬片；目标细胞（如：转染24h 的细胞）胰酶消化后，用新鲜培养基吹打悬浮；取出盖玻片，酒精灯火焰灼烧至乙醇燃烧干净，盖玻片平放在6孔板内，接种细胞至六孔板，5%CO2培养箱37C 培养24h，细胞贴附在盖玻片上。
2. 收片；细胞贴附24h 后，去除培养基，加入预冷PBS 洗片，重复一次。
3. 固定；加入1ml 预冷的4%多聚甲醛，覆盖盖玻片，冰上孵育10-15min，PBS 洗片3次。
4. 透化；加入0.5ml 遇冷的0.5%Triton-100，冰上孵育5min ，PBS 洗片3次，吸尽表面液体。
5. 封闭；常温下，加入2ml 含10%FBS 的PBS ，孵育1h ，PBS 洗片1次。
6. 一抗孵育；稍晾干盖玻片，加入100ul 稀释好的一抗，室温孵育2h ，PBS 洗涤3次。
7. 二抗孵育；同上
8. 染核；加入0.5ml DAPI 工作液（1ug/ml ，PBS 稀释），覆盖盖玻片，室温孵育5min 。
9. 封片；PBS 洗片三次后，晾干，同时晾干载玻片后，滴上30ul 封片剂，盖上盖玻片，待观察。
Long Qi 2011-11-2。
细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤
细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤贴壁细胞免疫荧光法(1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min。
(2） 4%多聚甲醛固定细胞爬片15min。
(3） 1XPBS洗涤3 次，每次5min。
(4） 0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。
(5) 1×PBS 洗涤3 次，每次5min。
(6） 1%BSA室温封闭30min。
(7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
(8) 1 ×PBS 洗涤3 次，每次5min。
(9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。
(10) 1×PBS 洗涤3 次，每次5min。
(11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
(12）1×PBS洗涤3 次，每次5min。
(13）用抗荧光淬灭剂封片。
(14）荧光显微镜下观察采集图像。
悬浮细胞免疫荧光法（一)(1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
(2）离心吸去 PBS，4%多聚甲醛固定液，重悬细胞，置冰上固定30 min。
(3）离心、吸去固定液，用4℃ 1×PBS重悬细胞，离心800 g 离心5 min，去PBS，留细胞沉淀。
(4） 0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。
(5）离心800 g离心5 min，去通透液，留细胞沉淀。
▲注意:步骤（4）和(5）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤(6）使用1% BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
(7）离心800 g离心5 min，去封闭液，留细胞沉淀。
(8) 孵育一抗,浓度根据抗体说明书操作,4℃摇床孵育过夜(一般孵育15-16h)。
(9）用4℃ 1×PBS稀释细胞和抗体，离心，吸去PBS，以4℃ 1×PBS重悬细胞，重复1次。
组织免疫荧光
免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。
1. 样品准备(Sample preparation)对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。
也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。
这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。
对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
然后就可以进行后续操作。
如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。
对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
对于石蜡切片：脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。
无水乙醇5分钟，两次。
90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。
蒸馏水5分钟，两次。
抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。
2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。
固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。
3. 封闭(Blocking)加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
免疫荧光
免疫荧光
1.铺片：20微升PLL处理盖玻片，涂于玻片上置于37度培养箱晾干，置于24孔板底部（处理过的一面朝上）。
加入1*106/mL的细胞1毫升（按细胞大小选择所加入的细胞数，此为脾细胞），300g离心1min，吸取上层液。
注：如果是贴壁细胞的话就不需要PLL处理玻片，直接提前一天接种细胞，次日细胞自动贴到玻片上。
2.固定打孔：用4%的多聚甲醛250微升室温固定二十分钟，PBS洗两遍，每遍3min。
然后用250微升的0.3% Triton X室温打孔20分钟。
3.封闭：吸取上层液,250微升PBS洗两遍，加入2%的BSA（PBS溶解）250微升室温30min或4度过夜，封闭完无需PBS洗。
4.一抗孵育：1:1500稀释抗体每孔250微升室温45min到2h。
然后PBS洗三遍，每遍10min。
此后的步骤都应避光处理。
5.二抗孵育：1:1500稀释抗体，每孔250微升室温45min到2h。
然后PBS洗三遍，每遍10min。
6.染核：1:3000稀释DAPI，250微升每孔，处理3-5min，然后用PBS洗5-6遍。
7.封片：2-3微升封片剂（甘油，防淬灭剂），滴到载玻片上，取出盖玻片，有细胞的一面朝下置于载玻片上（不要有气泡）。
注：A 实验前应根据一抗的来源及所用荧光显微镜的通道来选择合适的二抗。
B 0.3% Triton X现配现用，2%BSA应提前配置，溶解很慢，4度储存不可超过一周以上，用前确保澄清，有杂物的话可离心去除。
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。
对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。
2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。
取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。
请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。
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贴壁细胞的免疫荧光染色方法Materials:1. PBS solution2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative):Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃to dissolve;3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution)4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution)5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot;6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manualProcedure:1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate;2. Remove medium, rinse with PBS twice;3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes;4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time;5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4?C for 10 minutes;6. Remove PBS-T solution, rinse cells with PBS for 5 minutes at room temperature;7. Block non-specific interaction with PBS-B solution at 37?C for 30 minutes;8. Add primary antibody solution, incubate at 4?C overnight;9. Remove primary antibody solution, wash with PBS for 5 minutes;10. Add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1 hour;11. Wash with PBS three times, 5 minutes each;12. Add anti-fade DAPI solution if needed;13. Observation.细胞免疫荧光步骤1.细胞爬片；2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油作为荧光显微镜使用：（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。
（2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。
（3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。
（4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。
按下相应附件上的照相按扭。
作为荧光显微镜使用：（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。
（2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。
（3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。
（4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。
按下相应附件上的照相按扭。
细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O2005-07-25 20:25免疫荧光第一步的步骤几注意事项1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.4. 不知道你的一抗是在胞浆表达还是在胞核表达如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.注意,PBS液的PH值要调在7.4左右孵育一抗不能干片,孵育一抗时间要久;其四,多余的封闭液不能洗掉,只能甩干2005-07-25 20:51总之,首先,应该注意的是片子有没进行了脱脂处理;其二,注意洗片用PBS的PH植要在7.4左右;其三,固定,孵育一抗不能干片,孵育一抗时间要久;其四,多余的封闭液不能洗掉,只能甩干;其五,要注意避光说了这么多,嘿嘿,最重要的一点是:你以后阐述问题的时候请具体一点,不要让回答问题的人遍地撒网,好累呀2009-01-23 10:50首先用16孔板没有任何问题分析没有荧光的结果1. 固定最好用4%多聚甲醛30min2. 一抗孵育时间太短我的经验37度2小时或者4度过夜效果更好3. 二抗孵育时间是多少？建议37度2--3小时我也有做过5个小时的最后你用的是那种ccd的荧光显微镜吗？有的时候染的不好镜下看不到荧光但是是可以照出来的！！Fix cells in 2% formaldehyde in PBS/pH 7.4 for 15 min. at 20oC. 2% formaldehyde is made up fresh prior to use by dissolving the appropriate amount of EM grade paraformaldehyde (Prill form, from Electron Microscopy Sciences) in PBS and heating on a hot plate in the hood (setting of 5-6) until the aldehyde goes into solution. Keep the bottle cap loosened so that pressure does not build up. Cool down to 20oC and pH to 7.4. Alternatively, cells may be fixed in 100% methanol at -20oC for 3 minutes. If methanol fixation is used skip to step 4.Wash in PBS 3 X 10 min.Permeabilize in 0.2% Triton X-100 plus 1% normal goat serum (NGS) in PBS/pH 7.3 for 5 minutes on ice.Wash in PBS + 1% NGS 3 X 10 min.Incubate in the appropriate concentration of primary antibody for 1 hour at room temp. in a humidified chamber. If using 22mm X 22mm square coverslips, 30 ul of diluted antibody is placed on the coverslip and the coverslip is inverted onto a glass slide. The slide is then placed in the humidified chamber which is incubated at room temp.Wash in PBS + 1% NGS 3 X 10 min.Incubate in secondary antibody (FITC or Texas Red conjugated) at a dilution of 1:50 for 1 hour in a humidified chamber at room temp.Wash in PBS 4 X 10 min.Mount coverslip with a drop of mounting medium (see Fluorescence Mounting Medium Protocol) and seal coverslip with clear nail polish to prevent drying and movement under the microscope.liguofan wrote:多聚甲醛固定[24孔中加多少啊？],0.5-1.0 ml;liguofan wrote:加1抗，[不用湿盒，如何防干燥？用个大饭盒，加上水，盖上盖，过夜？]parafilm覆盖，或将coverslips倒扣在载玻片上后照你的方法，另外饭盒里可以放上纱布；liguofan wrote:封片[如何做？]如果立即观察、拍照，可以用PBS封片，若放置一定时间则请用水溶性封固剂封片并置4度保存。