石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。
它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。
下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。
因此，第一步是将蜡块去蜡。
首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。
然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。
这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。
步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。
常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。
固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。
步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。
首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。
脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。
在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。
石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。
最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。
之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。
切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。
步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。
抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。
常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。
热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。
化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。
抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。
步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织得采集、固定与保存:采取组织后,方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4︒Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ)PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4︒C保存于7０%乙醇中。
２、组织得包埋、切片、展片及保存::固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54︒C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37︒C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。
石蜡包埋:保存于４︒Ｃ70％乙醇中得组织样品↓80％乙醇1５ｍin↓95%乙醇15 miｎ↓1０0%乙醇15mｉｎ⨯ 2↓1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin↓二甲苯透明5-１0 min↓1／２二甲苯１/2石蜡３0 min↓石蜡(1) 1。
5hｒ↓石蜡(2) 1.5－２.5hr↓石蜡(3) 包埋↓RT保存3、石蜡组织切片得免疫组化方法:密封保存于RT得组织切片↓二甲苯(1) 20 min↓二甲苯(2)20ｍin↓100％乙醇20ｍin↓95％乙醇10 min↓8０％乙醇10miｎ↓通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈↓切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2↓0.4%Tritonx RＴ10 mｉn↓切片在PＢS中浸泡 5 min＊3３％H２O2 RT １０ｍin切片在PBS中浸泡５ｍｉn*30、25％胰酶RT １0min切片在PBS中浸泡 5 min*３Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h切片在PBS中浸泡５min*3DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2)如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。
石蜡切片免疫荧光染色方法完整版
石蜡切片免疫荧光染色方法HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。
具体方法如下：（1）APES：现用现配。
将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。
用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
（2）HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogr ip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。
（3）Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。
装盒备用。
试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：（1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~4 0分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
（2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
（3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其 pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次；3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 ；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；8．避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M 终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。
2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。
手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
免疫荧光单标染色技术石蜡切片脱蜡至水的步骤
免疫荧光单标染色技术是一种用于检测特定抗原或蛋白质的方法，能够在细胞或组织中定位这些分子。
这种技术常常用于生物医学研究、临床诊断和药物开发中。
在进行免疫荧光染色之前，需要进行石蜡切片脱蜡至水的步骤，以确保样品的质量和稳定性。
第一步：脱蜡1.1 在进行免疫荧光染色前，首先需要将样品中的蜡质去除。
通常使用挥发性有机溶剂（如二甲基苯）来溶解蜡质，以达到脱蜡的目的。
1.2 脱蜡过程需要严格控制时间和温度，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质的影响。
1.3 脱蜡后，样品需要经过多次洗涤，以保证蜡质完全被去除。
第二步：水洗2.1 脱蜡后的样品需要经过一系列的水洗步骤，以移除残留的有机溶剂，并保证细胞或组织的完整性。
2.2 水洗过程需要使用高纯度的蒸馏水，并频繁更换，以避免污染和离子残留。
2.3 水洗后，样品需要进行去离子处理，以避免水中离子对免疫荧光染色的干扰。
免疫荧光单标染色技术通过上述步骤，可以在细胞或组织中准确地检测和定位特定抗原或蛋白质。
在这个过程中，严格控制的脱蜡和水洗步骤对于提高染色的敏感性和稳定性非常重要。
个人观点和理解：免疫荧光单标染色技术是一种非常重要的生物医学研究工具，它可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞和组织中的蛋白质定位和表达水平。
而其中的石蜡切片脱蜡至水的步骤，是确保染色质量的关键一环。
只有通过严格的处理和洗涤，才能保证样品的稳定性和免疫荧光染色的准确性。
总结回顾：通过本文的阐述，我们深入探讨了免疫荧光单标染色技术中石蜡切片脱蜡至水的关键步骤。
这些步骤不仅仅是简单的预处理，更是整个染色过程中样品质量的保证。
在未来的研究和实践中，我们应该更加重视这些细节步骤的执行，以确保最终的实验结果的准确性和可靠性。
在中文文章的写作中，要求对于指定的主题或概念进行全面评估，包括深度和广度，并根据主题文字撰写一篇高质量的文章，其中包含了详细的步骤和个人观点以及总结回顾性的内容。
文章的格式需要符合知识文章的要求，使用普通文本撰写，使用序号标注，总字数大于3000字。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
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对于石蜡切片：
1、烤片：60C 60分钟
2、脱蜡：二甲苯中I脱蜡15分钟—二甲苯H脱蜡15分钟—无水乙醇
I 5分钟
—无水乙醇H 5分钟—90%乙醇I 5分钟—90%乙醇H 5分钟—70%乙醇5分钟
—蒸馏水5分钟—蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l 柠檬酸钠，pH6.0（柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中），上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷
缸中缓慢冷却至室温。
2.去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%HO2 （2ml H 202加入
18ml蒸馏水中，现配现用，避光），室温孵育10分钟，PBS洗3次, 每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3.封闭（Blocking）
加10%E常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4C封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意
样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4.一抗孵育（Primary antibody incubation）
参考- -抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PB）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗，4 C过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5.二抗孵育（Secondary antibody inucubation）
按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，
立即加入稀释好的二抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小
时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6.蛋白检测(Detection of proteins)
对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观
察。
7.复染
用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS中洗5分钟X 3次，封片(封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1:1混合) 显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。
例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186) 进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。
0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方：
NaHC03 3.7g
Na2CO3 0.6g
双蒸水溶解至100ml，调节pH至9.5
(学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报)。