激光扫描共焦显微三维生物医学图象处理和重建.
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光共聚焦显微简介
一种现代先进成像技术：共焦显微术摘要：共焦显微术的概念自20世纪50年代末由美国的Minsky提出以来，由于其具有高分辨率特别是纵向高分辨率，以及数字图像三维层析的特点，逐渐受到越来越多专家的重视，被广泛应用于生物医学、材料科学、微电子制造、精密测量等领域的检测与分析。
本文简要介绍共焦显微术的原理，分析影响其性能的几个重要因素，讨论了几种较典型的共焦显微镜的构造和特点。
结合我们现有的技术储备，阐述了开发新型共焦显微镜的条件。
最后展望共焦显微镜的发展前景。
关键词：共焦，三维光学层析，纵向分辨率，扫描引言共焦显微术（Confocal Microscopy）的概念首先由美国的Minsky在20世纪50年代末提出来[1]，随后P.Davidovits, A.f.Slomba[2]和 C.J.R.Sheppard[3]等多位学者对共焦成像进行了更细致的研究。
越来越多的基于共焦原理的显微术被开发出来。
但是由于计算机发展水平的制约，直到70年代才有真正实用的共焦显微镜问世，80年代中期才有商品机型出售[4]。
九十年代以来随着计算机图像处理技术的发展，共焦显微术三维层析能力的优点也逐渐凸现出来，受到越来越多研究人员的重视。
近几年对共焦显微术的研究已形成了一个世界性的热潮，人们已经研制出了多种多样的共焦显微镜，如点扫描激光共焦显微镜、线扫描激光共焦显微镜、光纤激光共焦显微镜、荧光共焦显微镜、共焦干涉显微镜、全息共焦显微镜、非扫描激光共焦显微镜等等。
共焦显微镜具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的特点，使得它可以对样品的轴向进行光学层析，从而可以重构出样品的三维图像。
它突破了普通光学显微镜衍射极限的限制，横向分辨率是相同数值孔径的普通光学显微镜的1.4倍[1]。
纵向分辨率可以达到亚微米级，因此可以对厚的生物样品进行轴向层析。
通过对层析图像的重构，会得到样品的三维立体图像。
在探测器和样品前面加的小孔光阑使得只有当样品处于焦平面时的散射光才能被探测器所接收，大大削弱了杂散光的影响[5]，所以系统有很高的信噪比，图像有很高的对比度和清晰度。
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
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生物秀-专心做生物
Introduction
ž LSCM 是一种高科技显微镜
ž
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荧计光像无细光算探。损胞显机针伤三,微进的维镜 行得“ 立成图到光体生像像细学机物w为处胞构切秀w基理或片w-础组,”.专b织，使b心i内加用o做o部装紫.生c微了 外o物m细激 或结光 可构扫 见的描 光荧装 激光置 发,图荧
在生命科学领域的分子水平,细胞
及组织水平的研究中得到广泛应 用.
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ž 在细胞原位用特异探针标
ž 记激并 镜子出素用成的核,激像定磷酸光,位脂从,扫,蛋,而定多描白实性糖共质现及生,受聚,上定物多体w焦述量肽秀等w显大 检,w酶分-微分 测.专,子bb心io做o.生co物m
集(左图) ,这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长滤片和吸收波长滤片来完成对不同的
荧光标记进行选择性的成像。
ž 最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术（右图）,配上合适的激光源后,能够摆脱 传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长) ,这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧 光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料) 和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,
②用荧光标记细胞内的离子,可以单标记一种离子也可以多标记几种离子,检测细胞内如pH 和钠、 钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。
③用荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,通过对膜上、胞浆内多种免疫物质 的标记， 可以实现在同一张样品上同时进行多重物质标记,同时观察这些物质;
④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠、重复性优良; 数据图像可及时输出或长期储存。
共聚焦成像原理
共聚焦成像原理共聚焦成像是一种高分辨率的光学显微成像技术，它能够通过对样品进行扫描来获取高质量的三维图像。
共聚焦成像原理基于激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的工作方式，该技术结合了激光扫描显微镜和荧光显微镜的优点，广泛应用于生物医学研究领域。
共聚焦成像系统共聚焦成像系统由以下几个主要组件组成：1.激光器：产生高亮度、单色、准直的激光光束。
2.扫描装置：通过控制反射镜或振镜使激光束快速扫描样品。
3.物镜：用于聚焦激光束到样品上，并收集散射或荧光信号。
4.探测器：用于检测收集到的散射或荧光信号，并将其转换为电信号。
5.图像处理系统：对探测到的信号进行处理和重建，生成最终的图像。
共聚焦成像原理共聚焦成像原理基于荧光显微镜的激发和发射过程。
当样品中的荧光标记物与激光束相互作用时，会发生以下几个过程：1.激发：激光束照射到样品上时，荧光标记物中的某些分子会吸收激光的能量，从基态跃迁到激发态。
2.发射：经过一段时间后，激发态的分子会自发地退回到基态，并释放出多余的能量。
这些能量以荧光信号的形式被辐射出来。
3.收集：物镜收集样品上散射或荧光信号，并将其聚焦到探测器上。
共聚焦成像通过控制激光束的聚焦位置和扫描方向来实现对样品的三维扫描。
具体而言，它采用了以下几个关键步骤：1.聚焦：通过调节物镜与样品之间的距离，使得激光束能够在样品内部聚焦成一个非常小且高度聚集的点。
这个点被称为焦斑（PSF）。
2.扫描：通过控制扫描装置，将激光束沿着样品的水平和垂直方向进行快速扫描。
这样可以在样品的不同位置上获取散射或荧光信号。
3.检测：通过探测器检测收集到的散射或荧光信号，并将其转换为电信号。
4.图像重建：通过对探测到的信号进行处理和重建，生成最终的图像。
这通常包括去除背景噪声、增强对比度和调整亮度等步骤。
共聚焦成像优势共聚焦成像具有以下几个优势：1.高分辨率：由于共聚焦成像只聚焦在样品的一个非常小的区域内，因此可以获得比传统显微镜更高的分辨率。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光扫描共聚焦显微镜-仪器百科
一、激光扫描共聚焦显微镜简介激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图像仪器。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。
利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
二、激光扫描共聚焦显微镜原理在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。
同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。
激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。
组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。
在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。
因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。
以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。
三、激光扫描共焦显微镜的优点1.动态连续扫描及三维图像重组。
LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。
激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。
获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
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激光扫描共焦显微三维生物医学图象处理和重建
【中文题名】激光扫描共焦显微三维生物医学图象处理和重建【英文题名】 Processing and Reconstruction of Laser Scanning Confocal Microscopy 3D Biomedical Images 【中文摘要】激光扫描共焦显微(LSCM，Laser Scanning Confocal Microscopy)成象在生物医学中，特别是三维的显微结构研究方面有着重要的应用价值。
它可用于细胞和组织的形态检测和定位、立体结构重组、动态变化过程等研究。
它可提供定量荧光测定、定量图象分析等实用研究手段。
结合其它相关生物技术，在形态学、生理学、病理学、免疫学、遗传学等领域得到了广泛应用。
为了更加充分地发挥激光扫描共焦显微技术的优势，需要在图象处理技术，特别是在三维图象处理方面进行深入的研究。
本文的目的就是建立一个基于LSCM的三维图象处理的技术平台，从而为生物医【英文摘要】 Laser scanning confocal microscopy ( LSCM ) 3D imaging plays an important role in biomedicine, especially in 3D microstructural study. It can be applied in the study of cell morphologies and locations, 3D reconstruction, dynamic changes, etc. It can also be the practical research means for the quantitative measurement and analysis of fluorescence and images. Combined with some other relative biomedical techniques, it has been widely applied in morphology, physiology, pathology, immunology, genetics, and so 【中文关键词】激光扫描共焦显微三维成象. 生物医学图象处理. 三维图象分析和识别. 点扩展函数估计. 图象插值. 三维物体重建. 荧光显微术. 光学切片. 特征提取. 【英文关键词】 Laser scanning confocal microscopy 3D imaging. biomedical image processing. 3D image analysis and recognition. Point spread function estimation. Image interpolation.
3D object reconstruction. Fluorescence microscopy techniques. Optical slicing. Feature extraction. 关于博士论文原创性的郑重申明 5-006 中文摘要 006-008 英文摘要 008-14 第一章绪论 14-30 1．1 激光扫描共焦显微术的发展及应用 14-16 1．2 国内外研究现状及本文主要工作 16-27 1．3 本文研究的总体目标 27-28 1．4 论文安排 28-29 1．5 本章小结 29-30 第二章LSCM成象的基本原理 30-42 2．1 前言 30-30 2．2 LSCM成象系统的结构 30-32 2．3 LSCM成象系统的光学原理 32-33 2．4 LSCM成象的基本过程 33-35 2．5 LSCM成象系统的特点和应用 35-37 2．6 LSCM成象系统的现状和发展
37-39 2．7 LSCM成象系统的样本制备相关技术 39-40 2．8 LSCM成象系统的图象分析 40-41 2．9 本章小结 41-42 第三章 LSCM成象系统点扩展函数的估计和图象复原 42-58 3．1 前言 42-46 3．2 LSCM成象系统的图象降质原理
46-48 3．3 LSCM成象中光源与样本间的激光光路的点扩展函数估计 48-50 3．4 LSCM成象中样本的点扩展函数估计 50-53 3．5 LSCM成象中样本与检测器间激光光路的点扩展函数估计 53-53 3．6 LSCM成象系统广义点扩展函数估计 53-55 3．7 采用广义点扩展函数进行LSCM图象复原的实验和讨论 55-57 3．8 本章小结 57-58 第四章激光扫描共焦显微图象插值方法研究 58-77 4．1 前言 58-59 4．2 基于小波变换的图象插值研究 59-74 4．3 激光扫描共
焦显微图象的插值处理 74-76 4．4 本章小结 76-77 第五章 LSCM三维生物医学图象的分割 77-90 5．1 前言 77-78 5．2 循环递增阈值分割法 78-86 5．3 等高地图分割法 86-89 5．4 本章小结 89-90 第六章 LSCM三维物体的特征值计算 90-116 6．1 前言 90-91 6．2 主轴变换的特征抽取 91-97 6．3 距离变换的特征抽取 97-105 6．4 霍夫变换的特征抽取 105-115 6．5 本章小结
115-116 第七章 LSCM三维物体重建 116-140 7．1 前言 116-118 7．2 行程
法三维物体实体重建 118-122 7．3 叠片法三维物体实体重建 122-126 7．4 基于Marching Cube算法的三维物体表面重建 126-132 7．5 边沿跟踪轮廓拼接法三维物体表面重建 132-139 7．6 本章小结 139-140 第八章 LSCM三维图象处理的生物医学实验 140-151 8．1 前言 140-141 8．2 血管壁细胞的显微结构分析 141-147 8．3 细胞受体分布的分析 147-150 8．4 LSCM三维图象处理的技术平台说明 150-150 8．5 本章小结 150-179 全文总结 151-155 攻读博士学位期间的主要论文和成果 155-159 致谢 159-160 参考文献 160-179 附录彩色插图 179-185。