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抗血清制备及抗体效价测定

摘要 (4)【实验过程】 (3)PartⅠ. NDV 抗血清制备 (3)一、实验原理 (3)二、实验仪器、材料和试剂 (4)1. 仪器 (4)2. 材料 (4)3. 试剂 (4)三、方法和步骤 (4)（一）NDV 兔抗血清制备 (4)1. 家兔捉拿方法 (4)2. 家兔固定方法 (4)3. 初次免疫 (5)4. 二次免疫 (5)5. 终末免疫 (6)6. 试血 (6)7. 颈动脉放血 (6)8. 血清分离 (6)9. 抗血清保存 (7)（二）NDV 鼠抗血清制备 (7)1. 小白鼠的捉拿和固定 (7)2. 初次免疫 (7)3. 二次免疫 (8)4. 终末免疫 (8)5. 试血 (8)6．放血 (9)7．血清分离 (10)8．抗血清保存 (10)Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (10)一、基本原理 (10)二、实验仪器、材料和试剂 (10)1. 仪器 (10)2. 材料 (10)3. 试剂 (10)三、方法和步骤 (10)1. 灭活鸡新城疫病毒Ulster 2C 株抗原提取 (10)2. 1%琼脂糖配制 (10)3. 倒平板 (10)4. 打孔 (10)5. 稀释抗血清 (11)6. 加样 (11)7. 孵育 (11)8. 结果观察 (11)Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定NDV 抗血清效价 (12)一、基本原理 (12)二、实验仪器、材料和试剂 (12)1. 仪器 (12)2. 材料 (12)3. 试剂 (12)三、方法和步骤 (12)1. 鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活抗原提取 (12)2、抗原包被 (13)3. 封闭 (13)4. 洗板 (13)5. 稀释抗血清 (13)6. 加抗血清 (13)7. 洗板 (13)8. 加酶标二抗 (13)9. 洗板 (13)10. 显色 (13)11. 终止 (13)12. 读数 (14)13. 结果判定 (14)Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 (14)一、基本原理 (14)二、实验仪器、材料和试剂 (14)1. 仪器 (14)2. 材料 (14)3. 试剂 (14)（1）SDS-PAGE 相关试剂： (14)（2）Western blotting 相关试剂： (15)三、方法和步骤 (15)1. SDS-PAGE (15)2. 转膜 (16)3. 免疫检测 (16)（1）膜的封闭 (16)（2）洗膜 (16)（3）加入一抗 (17)（4）洗膜 (17)（5）与二级抗体作用： (17)（6）洗膜 (17)（7）Odessey 近红外成像仪扫描成像 (17)【实验结果及分析】 (17)NDV 抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。

多色荧光免疫组化

多色荧光免疫组化近年来，免疫组化技术（Immunohistochemistry，IHC）已被广泛应用于病理学研究。

多色荧光免疫组化（multi-color fluorescence Immunohistochemistry，MF-IHC）是一种多抗性IHC 技术，可以使用多种特异性抗体，同时检测多个标志物在一个切片上不同细胞类型以及细胞器中的同源性和功能性关系，为作出准确诊断和判断提供强大的依据。

本文将简要介绍多色荧光免疫组化技术的工作原理、应用以及发展现状。

一、多色荧光免疫组化工作原理1、抗体过程多色荧光免疫组化技术使用适当的抗体，如多色荧光免疫组化所使用的抗体，可以与细胞类型的不同标记物结合，为多色荧光技术提供了可能性。

2、组化技术为保证抗原检测的准确性，多色荧光免疫组化采用一系列特定的抗体技术，如Diaminobenzidine（DAB）或AEC。

抗体可以与血液、尿液、活细胞、细胞器或者病理标本的特定抗原结合，使它们可以被可见的颜色进行染色，而不同抗原的特异性抗体则可以使用不同的染料进行染色，以保证其清晰度。

3、荧光技术多色荧光免疫组化技术还使用特殊的荧光技术，其中包括使用特异抗体和多色荧光成像技术。

这种技术中，只需使用一种特异性抗体，就可以获得多个抗原的检测结果。

MF-IHC使用特定的荧光标记，将多种抗原特异性抗体和一种特定的抗体荧光素结合在一起，可以在一张切片中同时检测多个抗原，特异性抗体使用不同的荧光颜色标记，以保证其准确性。

二、多色荧光免疫组化的应用1、临床检测由于多色荧光免疫组化可以快速检测多个抗原，在临床实践中得到了广泛的应用，可用于对癌症细胞的表型检测，以及在辅助诊断中的分子病理学检测，用于基因表达的蛋白分析，有助于临床医生有效地选择治疗策略。

2、研究MF-IHC技术还可用于检测各种细胞的功能和结构变化，如细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移等，有助于提高药物和生物分子研究的准确性。

钌红染色和单克隆抗体免疫标记植物叶片中的果胶

林业工程学报，２０２２，７（３）：１００－１０６ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＤＯＩ：１０．１３３６０／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－１３５９．２０２１０８０１０收稿日期：２０２１－０８－０９㊀㊀㊀㊀修回日期：２０２１－１１－１０基金项目：国家自然科学基金（３１８７０５５１）；云南省万人计划青年拔尖人才项目（ＹＮＷＲ－ＱＮＢＪ－２０１８－１２０）㊂作者简介：李晓宝，男，研究方向为生物质复合材料㊂通信作者：李晓平，女，教授㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｘｐ８１０５２５＠１６３．ｃｏｍ钌红染色和单克隆抗体免疫标记植物叶片中的果胶李晓宝，孙振炳，姚曜，汤正捷，李晓平∗（西南林业大学云南省胶黏剂与胶合制品重点实验室，昆明６５０２２４）摘㊀要：果胶是植物组织中重要的化学组成成分之一，但目前关于植物叶片中果胶含量及表征的相关研究较少㊂为了更好地开发植物叶片的应用价值和发展潜力，利用草酸铵螯合法㊁钌红染色及单克隆抗体免疫标记法对６种植物叶片（杨树叶㊁云南松松针㊁刺槐叶㊁榆树叶㊁慈竹叶和大麻叶）中的果胶进行含量测定和表征㊂结果表明：大麻叶㊁杨树叶和榆树叶中的果胶含量（质量分数）较高，分别是１２％１７％，１０％１５％和１０％１７％；刺槐叶和云南松松针次之，为５％８％，１．５％２．５％；竹叶最少，不足１％；确定了植物叶片中有大量的果胶存在㊂钌红染色和单克隆抗体免疫标记法均可有效表征果胶的分布，即植物叶片中的果胶部分可以被钌红染色，被单克隆抗体标记的果胶成分在紫外荧光照射下有亮光；比较着色程度和荧光亮度，可以看出果胶成分主要分布于叶片的叶肉细胞中㊂经过４种单克隆抗体标记之后，６种叶片中的荧光分布没有显著区别，即４种单克隆抗体能够标记的特定糖分在６种叶片中均有分布，果胶中的糖分是呈混合分布的状态，没有特定的富集区域㊂关键词：果胶；植物叶片；钌红染色；单克隆抗体免疫标记中图分类号：Ｓ７１８．４７㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀㊀㊀㊀文章编号：２０９６－１３５９（２０２２）０３－０１００－０７ＲｕｔｈｅｎｉｕｍｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇｏｆｐｅｃｔｉｎｉｎｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓＬＩＸｉａｏｂａｏ，ＳＵＮＺｈｅｎｂｉｎｇ，ＹＡＯＹａｏ，ＴＡＮＧＺｈｅｎｇｊｉｅ，ＬＩＸｉａｏｐｉｎｇ∗（ＹｕｎｎａｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｏｏｄＡｄｈｅｓｉｖｅｓａｎｄＧｌｕｅＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｃｔｉｎｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓ，ｂｕｔｔｈｅｒｅａｒｅｌｉｍｉｔｅｄｒｅｌａｔｅｄｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｅｃｔｉｎｉｎｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅ，ｔｈｅａｍｍｏｎｉｕｍｏｘ⁃ａｌａｔｅｃｈｅｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｒｕｔｈｅｎｉｕｍｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅ⁃ｔｅｒｍｉｎｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｐｅｃｔｉｎｉｎｓｉｘｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓ，ｉ．ｅ．，ｐｏｐｌａｒ（ＰｏｐｕｌｕｓＬ．）ｌｅａｖｅｓ，Ｐｉｎｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓｌｅａｖｅｓ，Ｒｏｂ⁃ｉｎｉａ（ＲｏｂｉｎｉａｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａＬ．）ｌｅａｖｅｓ，ｅｌｍ（ＵｌｍｕｓｐｕｍｉｌａＬ．）ｌｅａｖｅｓ，ｂａｍｂｏｏ（Ｎｅｏｓｉｎｏｃａｌａｍｕｓａｆｆｉｎｉｓ）ｌｅａｖｅｓａｎｄｈｅｍｐ（ＣａｎｎａｂｉｓｓａｔｉｖａＬ．）ｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｅｍｐｌｅａｖｅｓ，ｐｏｐｌａｒｌｅａｖｅｓａｎｄｅｌｍｌｅａｖｅｓｈａｄｈｉｇｈｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆ１２％－１７％，１０％－１５％ａｎｄ１０％－１７％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲｏｂｉｎｉａｌｅａｖｅｓａｎｄＰｉｎｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓｌｅａｖｅｓｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙ５％－８％ａｎｄ１．５％－２．５％，ａｎｄｂａｍｂｏｏｌｅａｖｅｓｈａｄｔｈｅｓｍａｌｌｅｓｔｃｏｎｔｅｎｔ，ｗｈｉｃｈｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎ１％．Ｉｔｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｐｅｃｔｉｎｉｎｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓ．Ｂｏｔｈｒｕｔｈｅｎｉｕｍｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐｅｃｔｉｎ，ｔｈａｔｉｓ，ｔｈｅｐｅｃｔｉｎｐａｒｔｏｆｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓｃａｎｂｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｒｕｔｈｅｎｉｕｍｒｅｄ，ａｎｄｔｈｅｐｅｃｔｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗｏｕｌｄｈａｖｅｂｒｉｇｈｔｌｉｇｈｔｕｎｄｅｒｔｈｅｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｃｏｌｏｒｄｅｐｔｈａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓｗｅｒｅｄｉｒｅｃｔｌｙｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｔｏｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｈｅｃｏｌｏｒｉｎｇａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｓｉｘｌｅａｖｅｓ，ｈｅｍｐｌｅａｖｅｓ，Ｒｏｂｉｎｉａｌｅａｖｅｓ，ｐｏｐｌａｒｌｅａｖｅｓ，ａｎｄｅｌｍｌｅａｖｅｓｈａｄｍｏｒｅｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏ，ｆｏｌ⁃ｌｏｗｅｄｂｙＰｉｎｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ．Ｂａｍｂｏｏｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｔｈｅｌｅａｓｔｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｍｏｎｇｔｈｅ６ｔｙｐｅｓｏｆｌｅａｖｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｃｏｎ⁃ｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔｂｙａｍｍｏｎｉｕｍｏｘａｌａｔｅｃｈｅｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｈｅｍｐｌｅａｖｅｓ，ｐｏｐｌａｒｌｅａｖｅｓａｎｄｅｌｍｌｅａｖｅｓｈａｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｅｃｔｉｎ．Ｔｈｅｆｏｕｒｋｉｎｄｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ⁃ｌａｂｅｌｅｄｈｅｍｐｌｅａｖｅｓ，Ｒｏｂｉｎｉａｌｅａｖｅｓ，ｅｌｍｌｅａｖｅｓａｎｄｐｏｐｌａｒｌｅａｖｅｓｍｅｓｏｐｈｙｌｌｃｅｌｌｓｈａｄｂｒｉｇｈｔｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｃｏｌｏｒｄｅｐｔｈｔｈａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓ，ｔｈａｔｉｓ，ｔｈｅｍｅｓｏｐｈｙｌｌｃｅｌｌｓｈａｄｍｏｒｅｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔｔｈａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓ，ａｎｄｓｏｏｎ．Ｔｈｅｐｅｃｔｉｎｃｏｎ⁃ｔｅｎｔｓｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｖｅｉｎｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆｍｅｓｏｐｈｙｌｌｃｅｌｌｓ，ａｎｄｍａｉｎｌｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｎｍｅｓｏｐｈｙｌｌｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｂａｍｂｏｏｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｍｅｓｏｐｈｙｌｌｃｅｌｌｓｈａｄｌｅｓｓｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｍｏｒｅｖｅｉｎｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｆｔｅｒｌａｂｅｌｉｎｇｗｉｔｈ４ｋｉｎｄｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅ６ｋｉｎｄｓｏｆｌｅａｖｅｓ，ｔｈａｔｉｓ，ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｓｕｇａｒｓｔｈａｔｃａｎｂｅｌａｂｅｌｅｄｂｙｔｈｅ４ｋｉｎｄｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎ㊀第３期李晓宝，等：钌红染色和单克隆抗体免疫标记植物叶片中的果胶ｔｈｅ６ｋｉｎｄｓｏｆｌｅａｖｅｓ，ａｎｄｔｈｅｓｕｇａｒｉｎｐｅｃｔｉｎｉｓｉｎａｍｉｘｅｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔａｔｅａｎｄｔｈｅｒｅｉｓｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｒｅａ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｅｃｔｉｎ；ｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓ；ｒｕｔｈｅｎｉｕｍｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｉｍｍｕｎｅｍａｒｋｅｒｓ㊀㊀果胶是自然界最复杂的化学物质之一，常存在于植物的根㊁茎㊁叶和果实等组织中［１］，早在１８２５年就从胡萝卜（Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔａｖａｒ．ｓａｔｉｖａ）中被分离出来㊂果胶质是黏结不同细胞的物质，主要存在于细胞壁的初生壁和胞间层［２－３］，但对于存在多层细胞壁的细胞（如初生壁㊁次生壁和胞内层的木质细胞），果胶在各个细胞壁层之间的功能尚不明确㊂果胶分为直链区和毛发区，Ｄ⁃半乳糖醛酸通过α⁃１，４⁃糖苷键连接成主链，毛发区支链上的糖基种类则高达１６种，且会随着植物种类㊁果胶储存时间的变化而变化［４－５］㊂果胶应用广泛，可被应用于制备饮料㊁化妆品㊁保健品㊁药品㊁血浆替代品㊁重金属吸附剂等［６－８］㊂目前主要利用水果或果皮来生产果胶，除此以外，果胶还普遍存在于植物的根茎叶中㊂因此，植物叶片也可以用来提取果胶，但迄今为止对叶片中果胶含量和分布的研究报道甚少，尤其是利用单克隆抗体标记法对叶片中果胶进行研究的报道较少［９－１１］㊂为了更好地开发利用叶片中的果胶成分，对一些药用叶片提取剩余物进行进一步价值的提升有着非常积极的意义㊂例如，将工业大麻叶提取大麻二酚（ＣＢＤ）后再进一步进行果胶提取，将桉树叶提取桉树精油后再进一步提取果胶等，不仅可以拓宽果胶的原料来源，还可以提高植物叶片的利用价值和利用率㊂笔者根据ＧＢ／Ｔ１０７４２２００８‘造纸原料果胶含量的测定“对叶片的果胶含量进行测定，并利用钌红染色和单克隆抗体免疫标记法对叶片中的果胶进行标定㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料大麻（ＣａｎｎａｂｉｓｓａｔｉｖａＬ．）叶，采自云南农业科学研究院经济作物研究所；云南松（Ｐｉｎｕｓｙｕｎ⁃ｎａｎｅｎｓｉｓ）松针和慈竹（Ｎｅｏｓｉｎｏｃａｌａｍｕｓａｆｆｉｎｉｓ）叶，采自云南省昆明市；杨树（ＰｏｐｕｌｕｓＬ．）叶㊁刺槐（ＲｏｂｉｎｉａｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａＬ．）叶和榆树（ＵｌｍｕｓｐｕｍｉｌａＬ．）叶，采自山东省临沂市㊂６种叶片均为春季４５月采集㊂甲醛㊁冰醋酸和无水乙醇，均为分析纯；伦敦白胶（ＬＲＷｈｉｔｅ）树脂㊁钌红染色剂㊁ＴＢＳ缓冲液（ｐＨ７．４７．６，０．０５ｍｏｌ／Ｌ三乙醇胺缓冲盐水溶液）㊁ＴＢＳＴ缓冲液（ｐＨ７．４７．６，０．０５ｍｏｌ／Ｌ三乙醇胺缓冲盐水溶液＋质量分数０．１％Ｔｗｅｅｎ⁃２０）㊁山羊原血清㊁甘油ＰＢＳ封片剂㊂上述试剂均购自昆明硕阳生物有限责任公司㊂单克隆第一抗体材料共有４种，分别是：ＪＩＭ５抗同型半乳糖醛酸聚糖（单克隆抗体抗同型半乳糖醛酸聚糖）㊁ＪＩＭ７抗同型半乳糖醛酸聚糖（单克隆抗体抗同型半乳糖醛酸聚糖）㊁ＬＭ５抗⁃（１⁃４）⁃β⁃Ｄ⁃半乳聚糖［单克隆抗体（１⁃４）⁃β⁃Ｄ⁃半乳聚糖］和ＬＭ６抗⁃（１⁃５）⁃α⁃Ｌ⁃阿拉伯聚糖［单克隆抗体（１⁃５）⁃α⁃Ｌ⁃阿拉伯聚糖］㊂单克隆第二抗体为山羊抗大鼠（ＩｇＧ），是与第一抗体结合的抗体，可改善应用结果并减少假阳性或阴性结果㊂１．２㊀实验方法１．２．１㊀果胶含量的测定将６种风干的植物叶片进行粉碎，分别收集２０４０目（粒径４２０８４０μｍ），４０６０目（粒径２５０４２０μｍ），６０８０目（粒径１７８２５０μｍ），８０１００目（粒径１５０１７８μｍ）和１００目（粒径１５０μｍ）以上的５种粉末，在ＤＨＧ⁃９００３型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司制造）中干燥至质量恒定㊂准确称取１．０００３．０００ｇ样品，加入１００ｍＬ无水乙醇，８０ħ下抽提３ｈ，干燥至质量恒定；将样品置于２００ｍＬ烧瓶中加１００ｍＬ质量分数１％的草酸铵溶液，水浴加热冷凝回流３ｈ后倒去上清液；继续加入１００ｍＬ质量分数０．５％的草酸铵溶液冷凝回流２ｈ；用滤纸过滤，接着用热的蒸馏水清洗残渣３次以上，收集并蒸发掉大部分的滤液至７０８０ｍＬ；加入９０ｍＬ盐酸和酒精的混合溶液（１０００ｍＬ乙醇＋１１ｍＬ盐酸）静置１２ｈ以上，再用３０ｍＬ盐酸㊁酒精和水的混合溶液（１０００ｍＬ乙醇＋１１ｍＬ盐酸＋２５０ｍＬ蒸馏水）分３次洗涤；将滤纸和滤渣放入７５ｍＬ热氨水溶液（７５ｍＬ沸水＋１．５ｍＬ氨水混合）中煮沸，过滤；得到的滤液中加１００ｍＬ的０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液，搅匀静置１２ｈ；加入５０ｍＬ的１ｍｏｌ／Ｌ乙酸溶液，搅匀静置５ｍｉｎ后加入５０ｍＬ的１ｍｏｌ／Ｌ氯化钙溶液，搅匀静置１ｈ，煮沸５ｍｉｎ，过滤，热蒸馏水洗涤数次，收集滤渣于烘箱中烘干至质量恒定［１２－１３］㊂根据ＧＢ／Ｔ２６７７．２２０１１‘造纸原料水分的测定“测定水分㊂果胶的含量以测定的果胶酸钙的含量表示：１０１林业工程学报第７卷Ｘ＝ｍ１－ｍ()４００ｍ０１００－ｗ()ˑ１００％（１）式中：Ｘ为果胶的含量（以果胶酸钙计），％；ｍ为滤纸的绝干质量，ｇ；ｍ１为烘干至质量恒定后沉淀连同滤纸的质量，ｇ；ｍ０为试样质量，ｇ；ｗ为试样含水率，％㊂１．２．２㊀叶片切片制备叶片切片的制备主要包括样品采集固定㊁脱水㊁钌红染色㊁包埋和切片５个步骤㊂１）样品采集固定：分别采集新鲜杨树叶㊁云南松松针㊁槐树叶㊁榆树叶㊁慈竹叶和大麻叶；切成５ｍｍˑ５ｍｍˑ５ｍｍ（长ˑ宽ˑ厚）的小块，浸泡于由体积分数５０％甲醛⁃乙酸⁃乙醇（ＦＡＡ）固定液（９０ｍＬ体积分数５０％乙醇＋体积分数３８％甲醛和冰醋酸各５ｍＬ）中固定２４ｈ㊂２）脱水：将样品从ＦＡＡ固定液中取出，用琼脂固定，将琼脂固定的叶片切成宽３ｍｍ的细条状，然后用体积分数５０％乙醇浸泡脱水，接着分别用７０％，８０％，９０％和１００％乙醇梯度浸泡，每个梯度脱水４ｈ以上，１００％乙醇需进行２次脱水（６０ｍｉｎ以上）㊂３）钌红染色：钌红可以通过静电与羧基（酸性基团）结合，在电子显微镜下出现电子密度高度着色，在光学显微镜下则呈现出本色㊂叶片浸没于质量分数０．０２％钌红染色剂中，对叶片进行染色［１４］㊂４）包埋：采用伦敦白胶（ＬＲＷｈｉｔｅ）包埋［１５－１６］㊂将钌红染色和未染色的样品移至新的离心管中，用移液枪移取体积比为１ʒ１的无水乙醇和纯的伦敦白胶树脂混合溶液（由５０ｇ树脂＋０．９９ｇ催化剂配制而成）直到树脂完全没过样品，在室温下浸泡渗入４ｈ以上；接着用干净的镊子将材料放入新的离心管中，然后用移液枪移取纯度为１００％的伦敦白胶树脂加入离心管中直到树脂完全没过样品，静置２ｈ以上，重复数次；之后取出样品放入包埋用胶囊中，注入纯的伦敦白胶树脂，充满胶囊，将胶囊在不接触水的情况下用超声清洗机处理６０ｍｉｎ；接着用循环水真空泵抽真空３次（３５ｈ／次），最后将胶囊放入电热鼓风干燥箱中６５ħ聚合２４ｈ（６０ħ时聚合１６ｈ以上）㊂５）切片：在３７ħ水中将胶囊溶解，对聚合好的材料块进行修整，用切片机进行切片，厚度为５１０μｍ，将切好的切片置于滴有水滴的干净载玻片上；接着将放有切片的载玻片放在７０ħ的烘干台上，烘烤至少５ｍｉｎ，直到水滴蒸干，切片完全干燥平铺于载玻片；切片完全干燥后，为保证叶片中果胶成分能够被充分染上颜色，钌红染色的样品可再一次进行染色，烘干待用［１７－１９］㊂１．２．３㊀免疫标记将切好的未被染色的切片连同载玻片置于ＴＢＳ和ＴＢＳＴ的混合缓冲溶液中浸润１０ｍｉｎ；取出玻片，将山羊原血清和ＴＢＳＴ缓冲液混合配出１／３０的山羊原血清溶液滴加在玻片上，将半薄切片封闭１ｈ；然后，分别在４个载玻片上滴加经ＴＢＳＴ缓冲溶液稀释为１／４的单克隆第一抗体（ＪＩＭ５㊁ＪＩＭ７㊁ＬＭ５和ＬＭ６），并在４ħ的冰箱中与半薄切片反应１２ｈ以上；接着用ＴＢＳ洗涤３次（５ｍｉｎ／次），洗涤后风干玻片；再用经ＴＢＳＴ缓冲溶液稀释为１／１００的单克隆第二抗体［山羊抗大鼠（ＩｇＧ）］对半薄切片进行封闭，在３７ħ烘箱中烘干１ｈ；用ＴＢＳ缓冲溶液清洗样品，清洗５次（５ｍｉｎ／次），之后用蒸馏水清洗２次（５ｍｉｎ／次）；置于干燥通风处晾干，用甘油ＰＢＳ封片剂封片，用荧光显微镜进行拍照㊂２㊀结果与分析２．１㊀不同叶片中的果胶含量经测定６种叶片在样品尺寸不同时的果胶含量（质量分数）不同，测定结果见表１㊂工业大麻叶片的果胶含量为１２％１７％㊁杨树叶片为１０％１５％㊁榆树叶片为１０％１７％㊁刺槐叶片为５％８％㊁松针为１．５％２．５％㊁慈竹叶在１％以下，其中工业大麻叶片㊁杨树叶㊁榆树叶的果胶含量在６种叶片中相对较多，刺槐叶片次之，慈竹叶的果胶含量在６种叶片中最少㊂对于同一种叶片，当颗粒尺寸由２０４０目减表１㊀不同植物叶片中的果胶含量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓ样品尺寸／目果胶含量（质量分数）／％大麻叶松针刺槐叶杨树叶榆树叶慈竹叶２０４０１２．４１ʃ０．２７１．６４ʃ０．０６５．５９ʃ０．５５１１．５８ʃ０．６４１３．０９ʃ１．２００．５３ʃ０．０６４０６０１１．９９ʃ０．２５１．９６ʃ０．０９５．８６ʃ０．９４１２．５６ʃ０．８８１６．１６ʃ１．７８０．７３ʃ０．１６６０８０１６．６１ʃ１．５１２．３０ʃ０．１３７．８７ʃ１．０６１４．３８ʃ０．３２１６．１４ʃ０．７２０．８８ʃ０．０５８０１００１５．５１ʃ１．６５２．０７ʃ０．１３５．４４ʃ０．９５１３．１６ʃ１．４３１２．７６ʃ１．０６０．８６ʃ０．１３１００以上１４．４０ʃ０．６８１．６８ʃ０．１８５．００ʃ０．４５１０．２１ʃ０．９２１０．１５ʃ１．２９０．６７ʃ０．１１㊀注：数值代表每类样本３次重复的平均值ʃ标准差㊂２０１㊀第３期李晓宝，等：钌红染色和单克隆抗体免疫标记植物叶片中的果胶小到８０目时，叶片的果胶含量都在逐渐地增加，而当颗粒尺寸小于８０目时叶片的果胶含量开始逐渐地降低㊂这可能是由于果胶主要存在于胞间层和初生壁中，在植物细胞生长过程中起着调控作用，有一定的韧性，不易被粉碎，所有在８０目以下颗粒中主要是生物质材料的其他化学成分，有待进一步研究㊂２．２㊀不同叶片中的钌红染色图像６种植物叶片经钌红染色后的果胶分布见图１㊂植物叶片中的果胶成分能够被钌红染色剂染上红色，颜色深浅与果胶含量的多少成正比，对比６种叶片的着色情况，大麻叶㊁刺槐叶㊁杨树叶㊁榆树叶的果胶含量比其他两种多，松针次之，慈竹叶在６种叶片中最少㊂比较各组织的钌红着色深度，大麻叶㊁刺槐叶㊁榆树叶和杨树叶叶肉细胞的果胶含量比表皮细胞多；松针表皮细胞和静脉组织的果胶含量比叶肉细胞少，果胶多分布于叶肉细胞中；慈竹叶表皮细胞㊁叶肉细胞的果胶含量较少，静脉组织的果胶含量多一些㊂１．表皮细胞；２．叶肉细胞；３．静脉组织㊂ａ１ａ２）不同放大倍数下的大麻叶；ｂ１ｂ２）不同放大倍数下的松针；ｃ１ｃ２）不同放大倍数下的刺槐叶；ｄ１ｄ２）不同放大倍数下的杨树叶；ｅ１ｅ２）不同放大倍数下的榆树叶；ｆ１ｆ２）不同放大倍数下的慈竹叶㊂图１㊀钌红染色的６种叶片Ｆｉｇ．１㊀Ｓｉｘｋｉｎｄｓｏｆｌｅａｖｅｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｒｕｔｈｅｎｉｕｍｒｅｄ２．３㊀不同叶片中果胶的荧光图像２．３．１㊀不同波长荧光照射下的木质素粉与果胶粉免疫标记是以抗原和抗体的特异性结合产生抗原⁃抗体免疫复合物，通常是指使用荧光素㊁放射性同位素㊁酶㊁胶体和化学（或生物）发光剂作为标记，并且使用标记的抗体或抗原以及相应的抗原或抗体用于特异性抗原⁃抗体反应［２０］㊂Ｌ１Ｌ３和Ｐ１Ｐ３分别为木质素粉和经过ＪＩＭ５标记后的果胶粉在３种不同波长荧光［紫外（ＵＶ）荧光波长为３７２４５６ｎｍ，绿色荧光波长４９０５２０ｎｍ，黄色荧光波长５３０６１５ｎｍ］照射下的情况，如图２所示㊂由图２可知，３种波长下均有亮光，即木质素粉和经过ＪＩＭ５标记后的果胶粉在荧光照射下都有自发荧光；但比较Ｌ１和Ｐ１可以看到在ＵＶ荧光照射下，木质素粉的亮光暗淡且不明显，经过ＪＩＭ５标记后的果胶粉明显比木质素粉发出的荧光要亮且均匀，因此选择ＵＶ荧光作为光源照射，分析果胶在叶片中的分布状态㊂图２㊀不同波长荧光照射下的木质素粉与果胶粉Ｆｉｇ．２㊀Ｌｉｇｎｉｎｐｏｗｄｅｒａｎｄｐｅｃｔｉｎｐｏｗｄｅｒｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｓ２．３．２㊀单克隆抗体标记叶片中的果胶成分在ＵＶ荧光照射下经ＬＭ５㊁ＬＭ６㊁ＪＩＭ５㊁ＪＩＭ７这４种单克隆抗体标记的６种植物叶片果胶成分均发出亮光，发出亮光的强弱和果胶含量的多少成正相关的关系，结果见图３８㊂对比６种叶片发出亮光的强弱可以知道大麻叶㊁杨树叶㊁榆树叶㊁刺槐叶３０１林业工程学报第７卷的果胶含量比其他２种叶片多，云南松松针次之，慈竹叶在６种叶片中果胶含量最少㊂这与前面果胶含量测定及钌红染色的结果是一致的㊂比较叶片中不同部位荧光的亮度，４种单克隆抗体标记的大麻叶片㊁刺槐叶㊁榆树叶和杨树叶叶肉细胞的荧光亮度比表皮细胞部分亮，即叶肉细胞的果胶含量比表皮细胞多㊂以此类推，松针的表皮细胞和静脉组织的果胶含量比叶肉细胞少，主要集中在叶肉细胞中；慈竹叶表皮细胞㊁叶肉细胞的果胶含量较少，静脉组织较多㊂另外，经过４种单克隆抗体标记之后，６种叶片中的荧光分布没有显著区别，说明在这６种叶片中４种单克隆抗体能够标记的特定糖分均有分布，即果胶中的糖分是呈混合分布的状态没有特定的富集区域㊂１．表皮细胞；２．叶肉细胞㊂图３㊀４种单克隆抗体标记的大麻叶中的果胶成分Ｆｉｇ．３㊀ＰｅｃｔｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＣａｎｎａｂｉｓｓａｔｉｖａＬ．ｌｅａｖｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈ４ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１．表皮细胞；２．叶肉细胞；３．静脉组织㊂图４㊀４种单克隆抗体标记的云南松松针中的果胶成分Ｆｉｇ．４㊀ＰｅｃｔｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＰｉｎｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓｎｅｅｄｌｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈ４ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１．表皮细胞；２．叶肉细胞；３．静脉组织㊂图５㊀４种单克隆抗体标记的刺槐叶中的果胶成分Ｆｉｇ．５㊀ＰｅｃｔｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＲｏｂｉｎｉａｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａＬ．ｌｅａｖｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈ４ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ４０１㊀第３期李晓宝，等：钌红染色和单克隆抗体免疫标记植物叶片中的果胶１．表皮细胞；２．叶肉细胞㊂图６㊀４种单克隆抗体标记的杨树叶中的果胶成分Ｆｉｇ．６㊀ＰｅｃｔｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓＬ．ｌｅａｖｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈ４ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１．表皮细胞；２．叶肉细胞㊂图７㊀４种单克隆抗体标记的榆树叶中的果胶成分Ｆｉｇ．７㊀ＰｅｃｔｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＵｌｍｕｓｐｕｍｉｌａＬ．ｌｅａｖｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈ４ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１．表皮细胞；２．叶肉细胞；３．静脉组织㊂图８㊀４种单克隆抗体标记的慈竹叶中的果胶成分Ｆｉｇ．８㊀ＰｅｃｔｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＮｅｏｓｉｎｏｃａｌａｍｕｓａｆｆｉｎｉｓｌｅａｖｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈ４ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ３㊀结㊀论通过测定果胶含量（质量分数）㊁钌红染色和单克隆抗体标记技术来表征叶片中的果胶成分，确定了植物叶片中有大量果胶的存在，为发掘新的果胶提取来源提供了依据㊂具体结论如下：１）大麻叶㊁杨树叶和榆树叶中的果胶含量（质量分数）分别是１２％１７％，１０％１５％和１０％１７％，含量均在１０％以上，在６种叶片中较高，刺槐叶和松针次之，慈竹叶最少㊂２）钌红染色和单克隆抗体标记技术均可有效表征果胶，果胶含量与叶片钌红染色剂的着色深度㊁果胶单克隆抗体标记的荧光亮度均呈正相关关系㊂在６种叶片中，大麻叶㊁杨树叶和榆树叶被钌红着色的深度较深，免疫标记荧光亮度较亮，尤其是叶片的叶肉细胞，因此这３种树叶具有提取果胶５０１林业工程学报第７卷质的潜在价值㊂经过４种单克隆抗体标记之后，６种叶片中的荧光分布没有显著区别，即４种单克隆抗体能够标记的特定糖分在６种叶片中均有分布，果胶中的糖分呈混合分布状态，没有特定的富集区域㊂参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：［１］任多多，江伟，孙印石，等．果胶的分类㊁功能及其在食品工业中应用的研究进展［Ｊ／ＯＬ］．食品工业科技，２０２１－０６－２３．ＤＯＩ：１０．１３３８６／ｊ．ｉｓｓｎ１００２－０３０６．２０２１０２００６９．ＲＥＮＤＤ，ＪＩＡＮＧＷ，ＳＵＮＹＳ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｅｃｔｉｎｉｎｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ［Ｊ／ＯＬ］．ＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０２１－０６－２３．［２］ＣＯＳＧＲＯＶＥＤＪ．Ｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｃｅｌｌｗａｌｌ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＲｅ⁃ｖｉｅｗｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，２００５，６（１１）：８５０－８６１．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｒｍ１７４６．［３］ＰＬＯＭＩＯＮＣ，ＬＥＰＲＯＶＯＳＴＧ，ＳＴＯＫＥＳＡ．Ｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｒｅｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００１，１２７（４）：１５１３－１５２３．ＤＯＩ：１０．１１０４／ｐｐ．０１０８１６．［４］ＹＩＬＭＡＺＮ，ＫＯＤＡＭＡＹ，ＮＵＭＡＴＡＫ．Ｒｅｖｅａｌｉｎｇｔｈｅａｒｃｈｉｔｅｃ⁃ｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｉｎｌｉｖｉｎｇｐｌａｎｔｃｅｌｌｓｂｙｂｉｏｉｍａｇｉｎｇａｎｄｅｎｚｙ⁃ｍａｔｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０２０，２１（１）：９５－１０３．ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｍａｃ．９ｂ００９７９．［５］ＣＯＳＧＲＯＶＥＤＪ．Ｌｏｏｓｅｎｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｃｅｌｌｗａｌｌｓｂｙｅｘｐａｎｓｉｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７（６８０２）：３２１－３２６．ＤＯＩ：１０．１０３８／３５０３００００．［６］白岚，杜继煜．果胶在食品加工中的应用［Ｊ］．农业与技术，２００２，６：１１５－１１６．ＤＯＩ：ＣＮＫＩ：ＳＵＮ：ＮＹＹＳ．０．２００２－０６－０３７．ＢＡＩＬ，ＤＵＪＹ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｅｃｔｉｎｉｎｆｏｏｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ［Ｊ］．Ａｇ⁃ｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，６：１１５－１１６．［７］陈靖，陈孔荣．果胶一种有开发前途的药物制剂基质［Ｊ］．现代应用药学，１９９７，１４（３）：２２－２３．ＤＯＩ：１０．１３７４８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ１００７－７６９３．１９９７．０３．０１１．ＣＨＥＮＪ，ＣＨＥＮＫＲ．Ｐｅｃｔｉｎ：ａｐｒｏｍｉｓｉｎｇｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｅｐａ⁃ｒａｔｉｏｎｍａｔｒｉｘ［Ｊ］．ＭｏｄｅｒｎＡｐｐｌｉｅｄＰｈａｒｍａｃｙ，１９９７，１４（３）：２２－２３．［８］刘英，邱逸凡，许希贤．果胶研究和应用进展［Ｊ］．现代食品，２０１９，２４：１７－２０．ＤＯＩ：１０．１６７３６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｎ４１－１４３４／ｔｓ．２０１９．２４．００７．ＬＩＵＹ，ＱＩＵＹＦ，ＸＵＸＸ．Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｐｅｃｔｉｎ［Ｊ］．ＭｏｄｅｒｎＦｏｏｄ，２０１９，２４：１７－２０．［９］姚穆，孙润军，陈美玉，等．植物纤维素㊁木质素㊁半纤维素等的开发和利用［Ｊ］．精细化工，２００９，２６（１０）：９３７－９４１．ＤＯＩ：ＣＮＫＩ：ＳＵＮ：ＪＸＨＧ．０．２００９－１０－０００．ＹＡＯＭ，ＳＵＮＲＪ，ＣＨＥＮＭＹ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａ⁃ｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｃｅｌｌｕｌｏｕｓｅ，ｌｉｇｎｉｎａｎｄｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｎｄｓｏｎｏ［Ｊ］．ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，２００９，２６（１０）：９３７－９４１．［１０］孙毅，魏金凤．树叶资源及野生蔬菜开发利用的前景［Ｊ］．科技信息，１９９９（１）：１０－１１．ＳＵＮＹ，ＷＥＩＪＦ．Ｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｅａｆｒｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｗｉｌｄｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１９９９（１）：１０－１１．［１１］廖朝阳．绿叶的妙用［Ｊ］．林业与生态，２０１０，１１：２６．ＤＯＩ：１０．１３５５２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｌｙｙｓｔ．２０１０．１１．００１．ＬＩＡＯＣＹ．Ｔｈｅｍａｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｏｆｇｒｅｅｎｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．ＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＥ⁃ｃｏｌｏｇｙ，２０１０，１１：２６．［１２］龙海蓉，王齐玮，李晓平，等．生长期和植株性别对工业大麻杆果胶含量及质量的影响［Ｊ］．西北林学院学报，２０１６，３１（２）：２４４－２４８．ＤＯＩ：ＣＮＫＩ：ＳＵＮ：ＸＢＬＸ．０．２０１６．ＬＯＮＧＨＲ，ＷＡＮＧＱＷ，ＬＩＸＰ，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｇｒｏｗｔｈｓｔａｇｅａｎｄｐｌａｎｔｇｅｎｄｅｒｏｎｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｗｅｉｇｈｔｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｈｅｍｐ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｗｅｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１６，３１（２）：２４４－２４８．［１３］ＫＡＳＨＹＡＰＤＲ，ＶＯＨＲＡＰＫ，ＣＨＯＰＲＡＳ，ｅｔａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｐｅｃｔｉｎａｓｅｓｉｎｔｈｅｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｓｅｃｔｏｒ：ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，７７（３）：２１５－２２７．ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０９６０－８５２４（００）００１１８－８．［１４］朱进，彭玉全，李文静．一种观察植物内部显微结构的染色方法：２０１９１０３６３６９５．２［Ｐ］．２０１９－０８－２７．ＺＨＵＪ，ＰＥＮＧＹＱ，ＬＩＷＪ．Ａｄｙｅｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｏｒｏｂｓｅｒｖｉｎｇｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｌａｎｔｓ：２０１９１０３６３６９５．２［Ｐ］．２０１９－０８－２７．［１５］曾兵，吴佳海，王少青，等．一种组织完整㊁利于显微观察的植物组织切片的制备方法：２０１９１０１７８７４９．８［Ｐ］．２０１９－０６－０７．ＺＥＮＧＢ，ＷＵＪＨ，ＷＡＮＧＳＱ，ｅｔａｌ．Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓｅｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｉｎｔａｃｔｔｉｓｓｕｅａｎｄｇｏｏｄｆｏｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ：２０１９１０１７８７４９．８［Ｐ］．２０１９－０６－０７．［１６］杨晓冬，孙素，李一勤．硼缺乏导致花粉管细胞壁多糖分布的改变［Ｊ］．植物学报，１９９９，４１（１１）：１１６９－１１７６．ＤＯＩ：１０．３３２１／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－９０７２．１９９９．１１．００６．ＹＡＮＧＸＤ，ＳＵＮＳ，ＬＩＹＱ．Ｂｏｒｏｎｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｌｅａｄｓｔｏｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｏｆｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９９９，４１（１１）：１１６９－１１７６．［１７］曾月星，许明坤，丁水汀．鉴定木材显微切片制作技术［Ｊ］．人造板通讯，２００２，９（７）：１３－２０．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－５０６４．２００２．０７．００５．ＺＥＮＧＹＸ，ＸＵＭＫ，ＤＩＮＧＳＤ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｏｏｄｍｉｃｒｏ⁃ｓｅｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｗｏｏｄ⁃ｂａｓｅｄＰａｎｅｌＮｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，２００２，９（７）：１３－２０．［１８］李亚男，严炜，罗丽娟，等．一种低毒透明剂制作植物叶片石蜡切片的方法［Ｊ］．热带农业科学，２０１９，３９（４）：５８－６１．ＤＯＩ：ＣＮＫＩ：ＳＵＮ：ＲＤＮＫ．０．２０１９－０４－０１１．ＬＩＹＮ，ＹＡＮＷ，ＬＵＯＬＪ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐａｒａｆｆｉｎｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓｗｉｔｈａｌｏｗ⁃ｔｏｘｉｃｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔａｇｅｎｔ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２０１９，３９（４）：５８－６１．［１９］王皓翔．尖叶木犀榄叶片的石蜡切片制作［Ｊ］．宁德师专学报（自然科学版），２０１０，２２（２）：１８３－１８５．ＤＯＩ：ＣＮＫＩ：ＳＵＮ：ＮＤＳＸ．０．２０１０－０２－０１９．ＷＡＮＧＨＸ．ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐａｒａｆｆｉｎｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆＯｓｍａｎｔｈｕｓｃｕｓｐｉ⁃ｄａｔｕｍｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｉｎｇｄｅＴｅａｃｈｅｒｓＣｏｌｌｅｇｅ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ），２０１０，２２（２）：１８３－１８５．［２０］刘勇，ＫＡＳＨＩＮＯＧ，陈一瑋，等．运用免疫荧光法检测温热对于硼化合物细胞微分布影响［Ｊ］．中华临床医师杂志（电子版），２０１２，６（１０）：２６１８－２６２３．ＬＩＵＹ，ＫＡＳＨＩＮＯＧ，ＣＨＥＮＹＷ，ｅｔａｌ．Ｕｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓ⁃ｃｅｎｃｅｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｗａｒｍｉｎｇｏｎｔｈｅｍｉｃｒｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｂｏｒｏｎｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃｉａｎｓ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｄｉｔｉｏｎ），２０１２，６（１０）：２６１８－２６２３．（责任编辑㊀李琦）６０１。

走在盛世春风里

吴玉章于永利
吕昌龙吕同德
滕卫平田志刚向军俭
讷 ’
智
王润田吴长有
曾小峰
仲人前
张冬青
周光炎
张
周
建
联
张
捷
张叔人
朱迅
张学光
左丽
张
毓
郑德先
朱立平
外籍编委
刘
洋（）刘永军（）美美
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既往地关心杂志的成长。
名单如下：按拼音字母顺序排列）（
主
编
编
委
杨贵贞巴德年
安云庆
副主编
曹雪涛
巴德年
金伯泉
白云
沈倍奋
贲昆龙
田志刚
毕黎琦
周光炎
蔡美英曹雪涛陈同辛
储以微胡学强李东复曲迅
范丽安黄瑾李康生单保恩
苹作者及免疫学工作者们，阖家快乐，万事如意！
工
杂志每一步探索、每一次寻求、每一点进步，从来都没有离开过你们的支持；你们的每一次直言、每一点肯定、每一士
士句鼓励，不仅激荡着编者对杂志进一步发展的深刻思考，也化为期盼的目光注视并推动着杂志不断前行。
士
熊思东
富李

关于新疆生产建设兵团职称评定中论文要求及刊物级别认定有关问题的通知

关于新疆生产建设兵团职称评定中论文要求及刊物级别认定有关问题的通知兵职改办发〔2010〕14号各师、院校、兵团各专业技术职务系列，兵直各单位职改办：为了在职称评审中客观、准确地评价专业技术人员的学术理论水平，进一步提高评审质量，现将兵团职称评定中论文要求及学术刊物级别的认定等有关问题通知如下：一、关于职称评审中对专业技术人员的论文要求根据各专业系列评审条件，申报晋升相应的职称须由本人独立或作为第一撰写人或作为通讯作者，在相应级别的学术刊物上（不含增刊、综合刊、副刊、专刊、专辑）发表本专业学术论文。

二、关于刊物级别的认定(一)国家级（核心）学术刊物的认定认定国家级（核心）学术刊物的原则是：1.国家行业主管部委或全国行业学会主办的主要刊物。

2.刊物在同行读者中影响较大并具有较高的学术权威性。

3.国家重点本科院校学报。

国家级（核心）学术刊物的具体参考名录附后，此名录将跟踪学术期刊的变化情况进行动态管理。

(二)省部级学术期刊的认定认定省部级学术刊物的原则为：1．国家行业学会、专业学会和国家部委主办或主管的学术期刊(列入国家级（核心）学术期刊名录除外)。

2．省行业学会、专业学会和省直厅局主办或主管，经省级以上出版部门批准，公开发行的学术期刊。

3．省行业学会或省直厅局主办，经省级以上出版部门批准登记的学术期刊。

4．省部党报理论版及省部专业报理论版。

5．一般本科院校学报。

三、有关问题说明(一)下列情况一般不作为学术论文对待：1．评论、文摘、短篇报道、科普文章、科技新闻、综述、医学个案等。

2．会议简报、动态、讲座等资料性质的材料。

3. 在论文集上发表的论文。

（二）独立完成或作为第一完成人公开出版了本专业专著的，可视为在国家级（核心）学术刊物上发表论文2篇。

(三) 由于技术保密等原因，国家有关部门规定不得公开发表论文的部门、单位，其专业技术人员申报职称须附国家有关的保密规定。

（四）个别在国外学术期刊上发表的论文，由系列职改办征求专家意见后，确认刊发等级。

病理学技术—特殊染色最最全总结

病理学技术—特殊染色最最全总结病理学技术是医学研究领域中的一个重要分支，它利用各种不同的方法和技术，对组织和细胞进行分析和研究。

其中，特殊染色技术是病理学技术中的一个重要组成部分，通过使用不同的染色剂，有助于观察并区分不同的细胞和组织结构，以辅助诊断和研究。

以下是对特殊染色技术的最全总结。

1. PAS染色（Periodic Acid-Schiff染色）：PAS染色可以用于检测细胞和组织中的多糖物质，如糖原、粘多糖和黏多糖等。

PAS染色通过一系列的化学反应，将含有醛基的物质氧化，然后与PAS染料反应生成染色物质。

2. 铁染色：铁染色可用于检测细胞和组织中的铁含量，它可以帮助鉴别铁负荷过多或过少的情况。

常用的铁染色方法包括Perls染色和Prussian blue染色。

3.去脂酸和酶染色：去脂酸和酶染色用于检测细胞和组织中的脂质和酶活性。

去脂酸染色通过将组织切片浸泡在油酸中，然后用溴化黄染色，观察脂质的分布情况。

酶染色通过使用特定的染色剂来观察细胞中的酶活性，如碘化物染色用于检测过氧化物酶活性。

4.免疫组织化学染色：免疫组织化学染色是通过使用特异性抗体来检测细胞和组织中的蛋白质和其他分子。

常见的免疫组织化学染色方法包括免疫荧光染色和酶联免疫组化染色。

这些染色技术可以用于确定特定抗原的存在和定位，从而帮助确定疾病的诊断和预后。

5.组织切片染色：组织切片染色是一种常见的特殊染色技术，它可以用于检测细胞和组织中的结构和细胞器。

常用的组织切片染色方法包括伊红染色、苏木素-伊红染色和单色染色等。

6.核酸染色：核酸染色用于检测细胞和组织中的核酸结构和功能，其中最常用的核酸染色方法是荧光原位杂交（FISH）和DAPI染色。

荧光原位杂交可以用来检测染色体异常和基因重排等。

7.肉眼可见染色：肉眼可见染色是一种用于检测显微镜下不易观察到的细胞和组织结构的染色技术。

常见的肉眼可见染色方法包括钙化染色和淀粉样变染色等。

总结以上所述，特殊染色技术在病理学领域中具有重要的应用意义，通过使用不同的染色剂，可以对细胞和组织进行全面和准确的分析和研究。

如何向SCI收录的优秀期刊投稿：本刊发展部②

ｎｗｍｕｍｏｌｔｒＦｅｉｍｎｏｄｕａｏＴＹ７０ｉｙｏ２ｃｎｍｏｌｕｎｅｉｎｙｎｇｓｍｏｋｙｋｄｅａｌｔａｎｐｌｔｉｎｇｉｅｌｅｏｎｃｍｂｎｔｎｗｉｌｒｓａｎａｔ，ｖｎａｏｎｒｉｏｉａｉｔｏｏｏｈ
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ＥｕｏｅｃＤｅｎａｅＭｏｅｉＣｏｅａｉｅＳｕｙｒｐａｎＭＶＯｈＯＩｔｆｔｏｐｒｔｔｄｌｖＧｒｕ．ｌｃｂｃｎｒｌｄｓｕｙｏｃｈｎＯａｔｏｅｉｏｐＰａｅｏ— ｏｔｏｌｔｄｆｍｙｏｐｅＩｅｍｆｔｅｌｃｍｂｎｄｗｉｈｃｃｏｐｒｎｏｔｏｓｅｏｄｅｅｔｆｏｉｅｔｙｌｓｏｉａｄｃｒｉｔｒｉｓｆｐｒｖｎｉｏｎｃｏｒｏｎ
ｃｃｏｐｒｅｏＡＤＴａｓｌｎａｉｎ２Ｏ：４７：５－６．ｙｌｓｏｉｒｎＲ．ｒｎｐａｔｔ．０２７（）１９０ｏ９【０ＴｏｃｓＳｅｋｗｓｉＭ．ｎ，ｔ１Ｐｏｈｌｘｆｃｔ２】ｒｎｏｏｔｐｏｋＳＷａｇＭＥｅ．ｒｐｙａｉｏｕｅａｓａｒｎｌｌｇａｔｅｅｔｎｕｉｇＦＹ２ｏｉａｉｎｗｉｅａｌｒｆｒｉｃｉｓｎＴ７０ｉｃｍｂｎｔｔａｏｏｎｏｈ

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。

底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。

结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。

该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。

洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。

然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。

但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。

近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。

竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。

夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。

ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。

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ｎｄａｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ（Ｔｅｇｒ）ｉｎｈｕｍａｎｏｒｇａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｕｔｏ —
的相关因素，可能对治疗有指导意义］。另外，也
达量的进一步关系，本实验未进一步验证、证实相关
展［Ｊ］．中国中西医结合肾病杂志，２００７，８（６）：３６５－３６７．
［５］张义东，王青青．ＣＩＭＣＤ２５Ｆｏ￣ｐ３调节性Ｔ细胞在ＨＤＣＰ外周血中水平变化及其意义［Ｊ］．中国免疫学杂志，２０１５，３１
善，监测ＰＭＮ患者外周血Ｔｒｅｇ、Ｔｈｌ７的变化可能有助于指导治疗。
［１２］ＧｏｕｍｅｎｏｓＤＳ．Ｗｈｔａｈａｖｅｗｅｌｅａｒｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｕｓｅｏｆｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ
８４９－８５９．

［１１］李世军，刘志宏．改善全球肾脏预后组织（ＫＤＩＧＯ）临床实践
指南：肾小球肾炎［Ｊ］．肾脏病与透析肾移植杂志，２０１２，２１
（３）：２６０－２６７．
达异常，且经过他克莫司治疗后Ｔｒｅｇ、Ｔｈｌ７有所改
芳．妊娠期高血压疾病对出生结局的影
响及相关因素［Ｊ］．中华疾病控制杂志，２０１４，１８（２）：３７１－３７４．［７］ＭｒａｌｉＢ，ＬｏｍｂａｒｄｉＧ，ＬｅｃｈｌｅｒＲＬｈｅＴｒｏｌｅｆｏＴｈｅｌｐｅｒ１７（ｈｌＴ７）
Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ２０１４，２６：３１－３６．
［１Ｏ］ＢｕｃｋｎｅｒＪＨ．ＭｅｃｈａｎｎｉｓｍｓｆｏｉｍｐｍｒｅｄｒｅｕｌｇａｔｉｏｎｂｙＴｃｅｌｌｓｉｎ
（１２）：１２５３ — １２５６．
性，但本研究结果仍可表明对治疗可能是有一定的指导性意义。有研究提示，Ｔｈ１７和Ｔｒｅｇ，ＣＩＭ和
ＣＤ８两组对立细胞的平衡也是患者对治疗和预后
［６］冯永亮，彭婷婷，王
ｕｎｏｍｅｄｕｌａｔｉｏｎ，２００７，１４：１３４・１３８．
明显的意义。本研究结果ＰＭＮ患者体内Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ表达异常，证实其参与原发性膜性肾病的发病机制。
ＮＫ细胞是先天性免疫系统中的重要成分，本研究结果提示ＰＭＮ患者组的ＮＫ细胞（ＣＤ１６ＣＤ５６标
有研究表明，ＰＭＮ患者出现明显Ｂ细胞异常及
ＣＤ４／ＣＤ８偏移¨ 。但由于本实验研究样本量较
小，随访时间不长，外周血淋巴细胞的表达，未提示
ｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ，２００７，１４８：３２－４６．
［８］ＪａｖｉｅｒＬｅｃｅｔａ，ＲｏｓａＰ，Ｇｏｍａｒｉｚ，ｅｔａ１．Ｖａｓｏａｃｔｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｒｅｕｌｇａｔｅｓ
Ｔ｝ｌ１７ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｉｎｌｆａｍｍａｔｉｏｎ『Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｉｍｍ—
ｎｌ１７
・
１６７１・
周血Ｔｒｅｇ的表达逐渐增加，Ｔｈｌ７表达的减少，尿蛋
［４］邹德平，曹
灵．Ｃ５ｂ９的形成与膜性肾病发病机制的研究进－
白减少，但是对于尿蛋白的多少与Ｔｒｅｇ及Ｔｈｌ７表
记）较健康对照组轻度降低。针对ＮＫ细胞在自身免疫性疾病中作用的研究很多，但以动物为主，且结果不十分一致。综上所述，本研究结果显示
ＰＭＮ患者外周血存在Ｔｒｅｇ、Ｔｈｌ７、淋巴细胞亚群表
ｈｕｎｍａｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅｓｅａｓ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１０：
［９］ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＯｈａｒａｓｅｋｉＴ，ＹｏｋｏｕｃｈｉＹ，酣ａ１．Ｕｐｄｔａｅｏｎｅｔｉｏａｎｄ
ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＫａｗａｓａｋｉｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＣｕｒｒＯｐｉｎ