第三节病毒
第三节：病毒感染力的滴定
获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。
• 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，
通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下 一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到 纯化的病毒粒子。
噬斑技术的应用： 用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株 测定病毒悬液中感染病毒的含量
噬斑形成单位（plaque forming unit, PFU ） 概念：
每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液
中的感染性病毒浓度。 计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结 果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，
则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：
22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
毒所形成的空斑数，然后根据公式计算 PFU。
如果是作病毒纯化
•挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，接
种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板，
再于37℃ 5% CO2培养箱培养至完全发生病变。
• 一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定
TCID50，然后选TCID50较高者再作几轮空斑纯化，
一、病毒TCID50的测定 操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续 10倍的稀释，从10-1-
10-10。
将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一
稀释度作8孔，每孔接种100µ l。
在每孔加入细胞悬液100µ l，使细胞量达到3×105 个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
限性的病灶。
plaques
Procedures
操作步骤
将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层 吸弃培养液，加入含钙、镁的PBS（pH7.4）洗1-2
第三节 病毒培养
第二章病毒第三节病毒的培养病毒缺乏完整的酶系统，又无核糖体等细胞器，所以不能在无生命的培养基上生长，必须在活细胞内增殖。
因此，实验动物、禽胚以及体外培养的组织和细胞就成为人工培养病毒的场所。
而病毒的人工培养，是病毒实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的基本条件。
一、动物接种病毒经注射、口服等途径进入易感动物体后可大量增殖，并使动物产生特定反应。
动物接种分本动物接种和实验动物接种两种方法。
实验用动物，应该是健康的，血清中无相应病毒的抗体，并符合其他要求。
当然，理想的动物是无菌动物或SPF(无特定病原体)动物。
常用的实验动物有小白鼠、家兔、豚鼠、鸡等。
动物接种尽管是培养病毒的一种古老的方法，但也是一种现在生产中常用的方法。
动物接种培养病毒主要用于病原学检查，传染病的诊断，疫苗生产及疫苗效力检验等。
二、禽胚培养禽胚是正在孵育的禽胚胎。
禽胚胎组织分化程度低，病毒易于在其中增殖，来自禽类的病毒大多可在相应的禽胚中增殖，其他动物病毒有的也可在禽胚内增殖，感染的胚胎组织中病毒含量高，培养后易于采集和处理，禽胚来源充足，操作简单，由于具有诸多优点，禽胚是目前较常用的病毒培养方法。
但禽胚中可能带有垂直传播的病毒，也有卵黄抗体干扰的问题，因此最好选择SPF胚。
禽胚中最常用的是鸡胚，病毒在鸡胚中增殖后，可根据鸡胚病变和病毒抗原的检测等方法判断病毒增殖情况。
病毒导致禽胚病变常见的有以下四个方面：一是禽胚死亡，胚胎不活动，照蛋时血管变细或消失；二是禽胚充血、出血或出现坏死灶，常见在胚体的头、颈、躯干、腿等处或通体出血；三是禽胚畸形；四是禽胚绒毛尿囊膜上出现痘斑。
然而许多病毒缺乏特异性的病毒感染指征，必须应用血清学或病毒学相应的检测方法来确定病毒的存在和增殖情况。
接种时，不同的病毒可采用不同的接种途径（图2-8），并选择日龄合适的禽胚。
常用的鸡胚接种途径及相应日龄为：绒毛尿囊膜接种，主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖，用10～13日龄鸡胚；尿囊腔接种，主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖，用9～12日龄鸡胚；卵黄囊接种，主要用于虫媒披膜病毒及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的增殖，用6～8日龄鸡胚；羊膜腔接种，主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖，此途径比尿囊腔接种更敏感，但操作较困难，且鸡胚易受伤致死，选用10～11日龄鸡胚。
环境工程微生物学-3病毒新
第二节 毒粒的性质 一、毒粒的形态结构
1、病毒的大小和形状
个体小，必需在电镜下观察；
不同病毒的毒粒大小差别很大； 毒粒的形状:动物病毒有球状、卵圆状、砖形
植物病毒有杆状、丝状、球状 噬菌体有蝌蚪状和丝状
采用各种电镜技术观察毒粒的形态结构
Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎病毒) （负染技术）
结构蛋白
构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质
壳体蛋白； 包膜蛋白； 存在于毒粒中的酶；
2、病毒的蛋白质
二、毒粒的化学组成
病毒结构蛋白的主要生理功能：
1）构成蛋白质外壳，保护病毒核酸免受核酸酶及其它理化 因子的破坏；
2）决定病毒感染的特异性，与易感细胞表面存在的受体具 特异性亲和力，促使病毒粒子的吸附和入侵；
第三节 病毒的复制
一、病毒的复制周期
1、一步生长曲线（one step growth curve）
1939年，Max Delbruck & Emory Ellis： 该实验标志着分子病毒学、分子生物学和分子遗传学的建立 Max Delbruck因此荣获1969年NobelEP.rcizoeli / bacteriopage 1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞； 2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）； 3、将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放 的噬菌体感染其它细胞； 4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量 进行计数）； 5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出 病毒特征性的繁殖曲线；
噬菌体 X174只有12个衣壳粒，最大的廿面体 是由1，472个衣壳粒组成的昆虫病毒粒子。
（3）复合对称的代表－T偶数噬菌体
病毒的结构-畜牧微生物学
第一节 病毒的结构 病毒（Virus）：是一类严格细胞寄生的最小的生物。
病毒是如何发现的？
1892年俄国伊凡诺夫斯 基报道，烟草花叶病的 病原体能通过细菌滤器。 1898年荷兰学者 Beijerinck重复并证实 这一发现，命名为病毒。
病毒特征
① 最小的生物，用电子显微镜才能观察到，由蛋白质和 核酸组成。
特点： 1. 喜冷怕热，不耐高温，耐低温：4℃、-20℃、-70 ℃、
-196 ℃，不同的病毒不一样。 2. 对紫外线敏感，可杀灭病毒。 3. 碱类、70%酒精、0.5 %石炭酸、重金属盐类等可杀灭病毒 4. 脂溶剂
第五节 病毒的分类
一、根据病毒寄生的宿主分类
动物病毒 植物病毒 昆虫病毒 微生物的病毒——噬菌体
病毒的基因组：差异非常大
圆环病毒：1.7 Kb
狂犬病毒：12 Kb
疱疹病毒：150 Kb
传染性核酸：噬菌体或某些病毒的核酸注入易感细 胞内，即引起感染，并产生完整的病毒颗粒。
二、蛋白质
1. 结构蛋白（Structural protein）: 组成病毒的蛋白称为结构蛋白。 蛋白质占病毒总量的70%，构成衣壳和囊膜的主要成分。 蛋白的功能：保护病毒核酸，形成一定的病毒形态。
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第三章病毒
（四） 装配：
装配是病毒核酸和病毒蛋白质在宿主细 胞内合成子代病毒粒子的过程。 大多数DNA病毒的装配是在细胞核中进 行（痘病毒等除外），大多数RNA病毒 在细胞质中进行；有被膜的病毒从细胞 中获得被膜。
（五） 释放：
释放是病毒粒子从感染细胞内转移到外 界的过程。方式一般有两种： （1） 没有被膜的DNA或RNA病毒，在 装配完成后合成溶解细胞壁的酶，以裂 解寄主细胞的方式使子代病毒一齐释放， 如：T4等。释放量一般在100---100000个 左右。病毒可反复感染周围细胞，从而 使寄主出现空斑、枯斑或其它症状。 （2） 有被膜的病毒以出芽方式释放，多 为动物病毒，如流感病毒，疱疹病毒等。 (3)植物病毒依靠胞间连丝在细胞间扩散。
二、温和噬菌体和溶源性细菌：
如大肠杆菌入噬菌体只是将其DNA整合在寄主细胞的 核酸分子中，并随寄主细胞的分裂而分配到子细胞中， 这种噬菌体称为温和噬菌体，又把整合在寄主染色体 上的噬菌体或病毒核酸称为原（前）噬菌体或原（前） 病毒，而含有原噬菌体的细菌称为溶源性细菌。 溶源细菌对同源噬菌体有免疫性，即从一种溶源菌中 释放的噬菌体不感染同一种溶源菌。因此要测定溶源 菌中的噬菌体必须在溶源菌平板上同时加入敏感的非 溶源性指示菌。 温和性噬菌体一般用括号（）表示，写在寄主细菌菌 株号的后面。如E、coliK12（入），表示入噬菌体是 一种温和噬菌体，寄生在大肠杆菌K12菌株细胞内。 细菌溶源化和非溶源化主要取决于温和噬菌体的CI基 因。若CI突变则会裂解细菌细胞。
（三） 生物合成：
病毒的生物合成包括核酸复制和蛋白质合成两 部分。大部分DNA病毒在宿主细胞核内合成 DNA，在细胞质内合成蛋白质，绝大部分RNA 病毒其RNA和蛋白质都在细胞质中，也有少数 例外情况。 有些病毒的生物合成必须依靠另一种病毒的 帮助，如腺病毒卫星病毒，尽管它也有自己的 DNA，但不能单独在寄主细胞内增殖，只有与 腺病毒一起存在时才能在核中自由复制。腺病 毒又称助长病毒，病毒卫星病毒又称缺损病毒。
03.第三章病毒的复制
每 个 细 胞 的 感 染 复 数
产量 细胞外病毒
感染病毒后 小时
吸附和侵入
隐蔽
成熟
释放
第二节 病毒的复制过程
一、吸附
二、侵入 三、脱壳
四、病毒生物大分子的合成
五、病毒与细胞表面的相互作用，是病毒复制的第一步。 多数病毒的吸附过程一般分两个阶段： 病毒粒子吸附到细胞表面，吸附是由于不同带电粒子间因 静电引力而结合。 病毒与受体的相互作用启动病毒进入细胞的动力学过程。
病毒脱壳后病毒的颗粒形式从受染细胞内消失，存在
于细胞内的是病毒的基因组。
囊膜病毒脱壳包括脱囊膜和脱衣壳两个步骤，无囊膜
病毒只需脱衣壳，脱壳方式随不同病毒而异。
四、病毒生物大分子的合成
病毒感染细胞后，利用宿主细胞合成核酸和蛋 白质的原料、场所、机制和能量，完成自身大 分子的生物合成。病毒的大分子生物合成包括 mRNA的转录、基因组的复制和病毒蛋白质合成 等。
五、装配和释放
病毒大分子合成产生的结构组分以一定方式结 合，组装成完整的子代病毒颗粒，这一复制阶 段称为装配。病毒的装配是一个复杂的过程， 是病毒复制、成熟和增殖的一个必要步骤。
第三节 病毒的非增殖性感染
一、非增殖性感染的类型
二、缺损病毒
一、非增殖性感染的类型
病毒的非增殖性感染主要有三种类型：流产感染、限制性感染 和潜伏感染。
二、侵入
整个病毒颗粒或其基因组及相关蛋白通过质膜屏障向 胞质转运的过程称为侵入。侵入的方式因病毒不同而
异，同一病毒也可以不止一种方式侵入。
从病毒侵入细胞的方式看，目前发现有3种类型：①病
毒囊膜和质膜融合；②细胞胞吞病毒；③病毒直接进
2.3病毒知识及防护(教案)四年级上册信息技术川教版
2.3病毒知识及防护（教案）四年级上册信息技术川教版教学内容：四川教育出版社小学信息技术四年级上册，第二单元：网络安全，第三节：病毒知识及防护教学目标：1、了解计算机病毒的定义及其特点2、学会预防计算机病毒的方法。
3、增强网络安全意识，学会保护个人财产安全。
教学重难点：学会预防计算机病毒的方法。
教学过程：一：图片引入观察图片上医生和病人的对话，思考：这种说法对吗？谈谈你对病毒的看法？病人：昨天，我用了一会儿电脑，然后就感冒了，肯定是我的电脑有病毒！医生：哇！这个病毒真厉害。
二：知识新授知识点1：什么是计算机病毒师：同学们知道病毒吗？你们听说过哪些病毒？生：学生积极讨论，举手回答，踊跃发言。
例：我知道新冠病毒。
师：很棒！大家提到的病毒多数都是会让我们生病的。
那大家知道什么是计算机病毒吗？计算机也会生病吗？计算机病毒是一些别有用心的人编写的对计算机有害的程序，从本质上说计算机病毒与常用的“记事本”“画图”程序没什么不同。
知识点2：计算机病毒的特点师：知己知彼，百战不殆。
我们必须了解这个敌人，才能更好的保护我们的计算机。
接下来，就让我们来了解了解它吧！①会传染②会隐蔽③会破坏计算机病毒被制造出来的目的或是恶作剧，或是对计算机进行破坏，或是盗窃用户资料。
编写和传播病毒程序是一种违法行为，病毒的制造者将受到道德的谴责和法律的制裁。
知识点3：病毒是怎样感染计算机的师：病毒的制造者是如何把病毒投放到我们的电脑上的呢？大家来猜一猜①通过软盘、光盘、U盘等存储设备传播②通过网络传播知识点4：怎样防范计算机病毒师：我们应该怎么做，才能减少被病毒感染的可能性呢？①及时对计算机里的数据进行备份，以便中毒后及时恢复。
②安装防毒杀毒软件、防火墙软件并及时升级。
③不要随意访问来历不明的网站，不要下载和安装来历不明的软件。
④不要打开来历不明的电子邮件。
⑤打开软盘、光盘、U盘等存储设备前先进行病毒扫描检查。
⑥及时安装操作系统升级补丁。
第三节 腺病毒
第三节腺病毒腺病毒（Adenovirus）是一群分布十分广泛的DNA病毒。
能引起人类呼吸道、胃肠道、泌尿系及眼的疾病。
少数对动物有致癌作用。
一、生物学性状腺病毒颗粒直径60～90nm，没有囊膜，20面体立体对称，衣壳由252个克微粒组成，其中240个壳微粒是六邻体(Hexon)，具有组特异性α抗原。
位于20面体顶端的12个克微粒是五邻体(Penton)。
每个五邻体由基底和伸出表面的一根末端有顶球的纤维组成。
基底具有毒素样活性，能引起细胞病变，并使细胞从生长处脱落，具有同组共有的β抗原。
纤维与病毒凝集大白鼠或恒河猴红细胞的活性有关，是型特异性γ抗原所在。
核酸为以股线状DNA，分子量20～30×106道尔顿。
腺病毒分为感染鸟类和哺乳动物的两个属。
人类腺病毒根据物理、化学、生物学性质分为A～G7组，每一组包括若干血清型，共42型。
根据对猴和大鼠红细胞的凝集能力又分为Ⅰ～Ⅳ组。
见表24-5。
表24-5 人类腺病毒分类及致病性*括弧中型别的一般不致病人类腺病毒不能在鸡胚中增殖，上皮样人细胞系HeLa细胞和人胚原代细胞培养最敏感，能引起细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串状的典型细胞病变。
腺病毒对酸碱度及温度的耐受范围较宽，36℃7天病毒感染力无明显下降。
对脂溶剂和酶类均抵抗作用，但56℃30分钟可将其灭活。
二、致病性与免疫性人腺病毒中部分型别有致病性，最常的是1～7型。
幼儿急性上呼吸道感染约5%由腺病毒引起，成人感染很少发生于呼吸道。
腺病毒致病情况见表24-5。
传播以粪一口为主途径，也可通过呼吸道或污染物品传播。
病毒在咽、结膜尤其是小肠上皮细胞内增殖，偶尔波及其他脏器，隐性感染常见。
疾病一般为自限性，感染后可获得长期持续的型特异性免疫力，中和抗体损伤作用重要。
A、B组病毒在某些新生动物可诱发肿瘤，对人未发现致癌作用。
三、微生物学检查（一）病毒分离自急性期病人咽、直肠、结膜等处采取标本，迅速接种敏感细胞，根据特征性细胞突变及抗原性鉴定病毒。
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病毒的种类：
（根据侵染细胞或寄主的不同可分为以下三种）
动物病毒是指专门 植物病毒是指专 寄生在人或动物细 门寄生在植物细 胞内的病毒 胞内的病毒
细菌病毒是指 专门寄生在细菌 细胞内的病毒
病毒与人类生产生活的关系：
1.对植物的影响
病毒引起的烟草花叶病
病毒使郁金香的花瓣出现花纹
2.对动物的影响
禽流感病毒使鸡患禽流感
病毒的种类
球形
杆形
蝌蚪形
二、病毒的生活特点
营养方式—寄生
病毒没有细胞结构，所以它们不能独立生活， 必须寄生在其他生物的细胞里才能体现生命 活动。
病毒通过空气、水、伤口、血液和 蚊虫叮咬等途径进行传播。
繁殖方式—病毒在寄主细胞中自我复制。
繁殖：以噬菌体侵染细菌为例
噬菌体进入大肠杆菌的细胞后，在 遗传物质的控制下通过一系列的步骤进 行自我复制。
2. 杆菌
形态： 球形、杆形、蝌蚪形 结构：蛋白质外壳和内部遗传物质
病
毒
Hale Waihona Puke 生活方式： 寄生 繁殖方式： 自我复制 种类： 动物病毒、植物病毒、细菌病毒（噬菌体） 与人类的关系：有益、有害
1、病毒比细菌（ ）得多，只有用能够放大 几万倍到几十万倍的（ ）才能观察到。 2、病毒都没有（ ）结构，不能（ ） 生活，只能寄生在（ ）内。 3、病毒往往通过（ ）、（ ）、（ ）、 （ ）、和（ ）、等途径传播。 4、病毒可以使人、动物、植物（ ），但是， 人们也可以利用动物病毒来杀灭（ ）。 二、判断题 1、有的病毒三十个拼接起来就有一个杆菌大。（ ） 2、专门寄生在细菌细胞内的病毒，叫做植物病毒。 （ ）
病毒与人类的关系
有 害 方 面 1.病毒能够使人、家禽、家畜和农作物患许多 传染性疾病，给人体健康和农作物生产带来重 大损失。
有 利 方 面
1.预防接种:制造病毒疫苗(流感疫苗、牛痘疫苗等)--控制一些疾 病。 2.利用病毒的特性，人们用绿脓杆菌病毒防止烧伤病人伤口受绿 脓杆菌感染化脓；用病毒防止手术后病人长伤疤等. 3.利用病毒可制高效的生物农药，如利用多角体病毒防治松毛虫、 粘虫等，即达到控制害虫的目的，对人畜健康和环境又完全无害。
第三节
病毒
你见过病毒吗?听说过病毒吗？想了解病毒吗？
病毒与人类的关系尤其是 人的健康非常密切。
病毒的发现
烟草花叶病毒
20世纪初 ， 科学家首次用电子 显微镜观察到烟草 花叶病毒是一种杆 状颗粒。
一、病毒的形态特点
1、病毒分布很广：陆地、海洋、天空，各种 动植物乃至动植物体内甚至细菌的体内，都能找 到它。 2、病毒的大小：病毒个体十分微小，多数病 毒在10--300纳米之间（百万分之一毫米），三 万个拼接起来才有一个杆菌大小。,所以病毒只 能用电子显微镜才能看见。 3、病毒的形态：球状（大蚊病毒），杆形（烟 草花叶病毒），蝌蚪状（噬菌体）等