核酸探针技术
第十二章 核酸探针检测技术
现代食品检测技术第二部分第12章核酸探针检测技术赵杰文邹小波江苏大学食品与生物工程学院第十二章核酸探针检测技术1 核酸探针的种类及其制备方法2 探针标记物与标记方法3 探针杂交与信号检测4 核酸探针在食品微生物检测中的应用1核酸探针的种类及其制备方法一、基因组DNA探针二、cDNA探针三、RNA探针四、寡核苷酸探针一、基因组DNA探针这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。
二、cDNA探针cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。
三、RNA探针mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想四、寡核苷酸探针用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响2 探针标记物与标记方法一、核酸探针标记物种类及其特点二、探针标记方法三、探针的纯化四、探针标记效率的评估一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性二、探针标记方法（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法（一）探针的放射性核素标记法1．缺口平移法2．随机引物法3．单链DNA探针的标记4．cDNA探针的标记5．寡核苷酸探针的标记缺口平移法（二）探针的非放射性标记法1．PCR标记法2．体外转录标记RNA探针PCR标记法体外转录标记RNA探针三、探针的纯化（一）凝胶过滤柱层析法（二）反相柱层析法（三）乙醇沉淀法四、探针标记效率的评估通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。
核酸荧光探针的设计和应用
核酸荧光探针的设计和应用随着生物技术的发展和突破，核酸荧光探针在遗传学、病毒学、药物研发等领域中得到广泛的应用。
本文将介绍核酸荧光探针的设计和应用。
一、核酸荧光探针的设计核酸荧光探针可以被分为两类，一类是“探针+靶标”，另一类是“探针+氧化还原剂”。
前者的原理是利用探针与靶标结合后，通过信号转导发出关于靶标的信息。
而后者则是直接在探针上标记一个氧化还原剂，使其发生氧化还原反应，从而发出荧光信号。
设计核酸荧光探针需要考虑两个因素：探针本身的性质和靶标的特异性。
探针本身应具有良好的荧光性质，如高荧光强度和较长的寿命，以便于准确测定其信号。
同时，探针应该具有发光与反应的特异性，以保证不受其他杂质或干扰物的影响。
在设计核酸荧光探针时，需要注意一些重要的角度：首先是选择标记物。
标记物的大小和化学活性将决定探针的靶向特异性和探针的合成方法。
其次是选择反映机制。
不同的反映机制可以用于反映核酸的变化，我们需根据实际情况选择不同的反映机制。
最后是考虑自身的生物学意义。
我们需对不同的机制研究设计探针，以满足不同的生物学需要。
二、核酸荧光探针的应用核酸荧光探针可以广泛应用于多种领域中。
下面我们将重点介绍一些常用的应用举例。
1、基于核酸荧光探针的分子诊断技术核酸荧光探针可以非常灵敏地检测DNA和RNA的变化，这为分子诊断技术提供了基础。
分子诊断技术通过检测某些特定基因或蛋白质的变化，以诊断一些常见疾病，如艾滋病、癌症等。
分子诊断技术具有高灵敏度、高特异性和快速等优点。
核酸荧光探针在诊断方面的应用已被广泛研究和开发。
例如，某些病毒、细菌或寄生虫性疾病的核酸荧光探针已被广泛应用。
2、基于核酸荧光探针的基因表达分析技术核酸荧光探针可以非常灵敏地检测基因的变化，包括基因表达和调节。
基因表达分析技术通过检测某些基因的变化，以研究这些基因的生物学功能和生物学作用。
基因表达分析技术具有高灵敏度、高特异性和快速等优点。
核酸荧光探针在基因表达分析方面的应用已被广泛研究和开发。
生物检测技术——核酸探针
3)单链DNA探针和双链DNA探针
➢ 用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与 被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之 间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果 使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一 问题。单链DNA探针的合成方法:(1)从Ml3载体衍生序 列合成单链DNA探针。(2)以RNA为模板用反转录酶合 成单链cDNA探针。
核酸探针的前景
➢ 基因芯片在环保方面、食品检测方面的研究报道比较少， 这将成为将来的研究方向。从某种意义上我们可以认为： 基因结构或种类决定物种，基因功能或表达则决定生命即 生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条 认识生命本质的捷径，同时它的发展也带动了蛋白质芯片、 细胞芯片、多肽芯片、组织芯片的发展和应用。
➢ 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱 基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定 基因片段的检测。
核酸探针的标记物
一.放射性标记
➢ 放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的 探针标记物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中， 以32P应用最普遍。
➢ 放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级； 缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、 不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实 现商品化。目前，许多实验室都致力于研究非放射 性标记的探针。
➢ 在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、遗传病的产 前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面以及特异性目的 基因及外源DNA的检测方面，核酸探针技术将越来越显出 其巨大的应用解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
➢ 双链DNA探针的合成方法：切口平移法和随机引物合 成法。双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必 须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链 目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温 度以下，可使探针保持单链状态。
常用核酸探针标记方法
常用核酸探针标记方法1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。
利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。
同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。
图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。
但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。
双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。
2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。
3）DNA模板要用纯化过DNA2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。
当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。
图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。
2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。
3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。
按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。
3、末端标记与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。
其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。
核酸探针的原理及应用
核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。
它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。
当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。
杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。
常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。
这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。
探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。
此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。
通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。
同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。
例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。
此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。
通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。
常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。
核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。
4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。
核酸探针杂交技术
核酸探针杂交技术核酸探针杂交技术是一种重要的分子生物学技术，也是基因工程研究中不可缺少的手段。
核酸探针杂交技术凭借其高度灵敏度和特异性，广泛应用于基因诊断、基因功能研究、基因表达定量分析等领域。
本文将详细介绍核酸探针杂交技术的原理、应用及其优缺点等方面。
一、核酸探针杂交技术的原理核酸探针杂交技术是指将标记有一定信号的核酸探针与待检测样品中的目标核酸序列进行杂交，然后利用特定的检测方法检测杂交产物，从而确定目标核酸序列的存在和数量。
核酸探针杂交技术通常可分为非放射性和放射性两种技术，其中非放射性核酸探针杂交技术应用更为广泛。
核酸探针杂交技术的原理基于两条互补的单链核酸分子可以通过碱基配对形成稳定的双链结构，当核酸探针与待检测样品中的目标核酸序列互补配对时，就会形成稳定的探针-目标杂交双链结构。
利用检测方法检测杂交产物的特定信号，即可确定目标核酸序列的存在和数量。
二、核酸探针杂交技术的应用1.基因诊断：核酸探针杂交技术可以用于检测许多人类疾病的基因突变、缺陷等变异，例如乳腺癌、先天性失聪等。
2.基因功能研究：核酸探针杂交技术可以用来检测基因表达水平的变化、基因启动子的区域及启动子序列。
3.基因表达定量分析：核酸探针杂交技术可以在高通量测序技术出现之前对基因进行表达定量研究。
4.生物学研究：核酸探针杂交技术可用于鉴定微生物特征DNA序列，研究细胞核酸拷贝数变异等。
三、核酸探针杂交技术的优缺点优点：1.特异性高：核酸探针杂交技术具有高度特异性，只能与完全互补的目标核酸生成双链结构，具有极低的假阳性率。
2.灵敏度高：核酸探针杂交技术具有高灵敏度，可以检测非常微小的核酸样品。
3.可操作性强：核酸探针杂交技术易于操作，不需要复杂的仪器设备。
缺点：1.核酸探针设计难度大：核酸探针杂交技术需要准确、特异性地设计核酸探针，相对来说比较困难。
2.分子杂交的条件严格：核酸探针杂交需要特定的配合物和条件，唯有达到特定的温度、离子强度等，才能保证探针与目标核酸的正确杂交。
核酸荧光探针及其分子诊断
核酸荧光探针及其分子诊断随着生物技术的不断发展和进步，现代医学研究已经越来越注重从微观角度来研究病因和治疗方法。
而核酸荧光探针及其分子诊断技术作为分子生物学领域的一项核心技术，已经被广泛应用于医学、生物学、化学等领域。
本文将探讨核酸荧光探针的基本原理和应用，以及分子诊断技术的发展和前景。
一、核酸荧光探针的基本原理核酸荧光探针是一种利用荧光技术来检测DNA或RNA的分子探针。
它通常由靶标区域的亲疏水性荧光基团和一个特异的核酸序列构成，在特定条件下通过荧光发射来检测靶标核酸序列。
核酸荧光探针基于荧光探针的原理，即当荧光分子受到光激发后，能量从高能级的激发态转移到低能级的基态时会发射光子。
核酸荧光探针的基本主要有以下三种：1.探针结构上融合有一些特定结构，例如融合环、芳香素等。
2.荧光染料作为基团标识，例如草酸羧基荧光素、罗丹明染料等。
3.与核酸序列配对的荧光标记物。
对于核酸荧光探针，可以根据其所含荧光标记的特异性，分为两种类型：基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)和基于荧光探针的杂交。
这两种方法不同于其他光学检测技术，因为它们不依赖于化学物质反应。
这种无需化学处理的技术是非常强大和灵敏的，因为它可以直接观察到包括DNA 结构突变等的生物反应。
二、核酸荧光探针的应用1、靶向分子的检测核酸荧光探针常用于靶向分子的检测。
例如Covid-19病毒核酸检测，是目前检测Covid-19病毒的主流检测方法之一。
核酸荧光探针能够与Covid-19病毒的核酸相结合，将分子自身和确诊病人样本抗原的能力结合，成为病毒检测的一种主要手段。
2、单细胞定量分析核酸荧光探针可用于单个活细胞的定量分析。
这项技术被广泛应用于癌症细胞免疫治疗、生理学研究等领域。
通过将特定荧光探针标记在细胞上，可以在特定条件下实现单个细胞级别的靶标检测和定量分析。
3、非侵入式实时检测核酸荧光探针可以通过实时荧光放大(Droplet Digital PCR, dPCR)技术进行非侵入性实时检测。
核酸探针技术的原理和应用
核酸探针技术的原理和应用引言核酸探针技术是一种重要的分子生物学工具，通过利用特异性的核酸序列与待测样品中的目标序列进行特异性配对，从而实现对目标序列的检测和定量分析。
本文将介绍核酸探针技术的原理以及其在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用。
一、核酸探针技术的原理核酸探针技术利用两条互补的核酸分子之间的碱基配对原理，通过标记的核酸序列与待测样品中的特定目标序列进行靶向配对。
该技术的原理主要包括以下几个方面：1.互补配对：核酸分子由四种碱基（腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们之间可以通过碱基配对形成双链结构。
腺嘌呤与胸腺嘧啶之间形成两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三个氢键。
根据这种碱基配对原理，核酸探针可以与目标序列中的特定碱基序列进行互补配对。
2.标记物：核酸探针常常需要进行标记以便于检测。
常用的标记物包括荧光染料、放射性同位素、酶和磁珠等。
标记物的选择取决于具体的实验需求和检测方法。
3.检测方法：核酸探针技术可以通过不同的检测方法进行信号的读取和分析。
常见的检测方法包括荧光检测、放射性测量、酶促反应和磁性检测等。
这些方法可以实现对标记物信号的定量分析和可视化显示。
二、核酸探针技术的应用核酸探针技术具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优势，被广泛应用于各个领域。
以下是核酸探针技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用：1.基因表达分析：核酸探针技术可用于研究基因的表达模式、调控机制和功能。
通过对目标基因的探针设计和合成，可以检测该基因在不同组织、细胞或条件下的表达水平。
2.病毒检测：核酸探针技术在病毒检测中具有重要意义。
例如，针对新型冠状病毒（COVID-19）的核酸探针被广泛应用于病毒的快速检测和筛查。
3.癌症诊断：核酸探针技术可用于癌症诊断和预后评估。
通过检测肿瘤标志物的核酸序列，可以快速、准确地判断患者是否患有癌症，以及癌症的类型和分级。
4.药物研发：核酸探针技术在新药研发中发挥重要作用。
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利用核酸探针进行பைடு நூலகம்毒检测
The End!
杂交信号的检测
? 当探针是放射性标记时，杂交信号的检测通过放射自显影进 行。即利用放射线在X光片上的成影作用来检测杂交信号。 操作时，在暗室内将滤膜与增感屏、X光片依序放置暗盒中， 再将暗盒置-70℃曝光适当时间，取出X光片，进行显影和定 影处理。
? 对于非放射性标记的探针，则需将非放射性标记物与检测系 统偶联，再经检测系统的显色反应来检测杂交信号。以地高 辛的碱性磷酸酶检测反应为例，地高辛(Dig)是一种半抗原， 杂交反应结束后，可加入碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体，使 之在膜上的杂交位点形成酶标抗体Dig复合物，再加入酶底 物如氮蓝四唑盐(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸甲苯胺盐 (BCIP)，在酶促作用下，底物开始显蓝紫色。其基本反应程 序类似ELISA，杂交信号的强弱，通过底物显色程度的深浅、 有无来确定。
玻璃板上DNA探针阵列
? 二、按标记物划分
? 有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放 射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性 同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标 记物。常用的同位素有 32P、3H、35S。其中，以 32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高， 可以检测到 Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位 素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标 记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致 力于发展非放射性标记的探针。
? 目前应用较多的非放射性标记物是生物素 (Biotin)和 地高辛(digoxigenin) 。
地高辛结构
核酸探针技术的优越性
? 被放射性或非放射性元素标记的探针以原位杂交、 Southern 印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不 同的方法 ,可直接用来探测溶液中、细胞组织内或 固定在膜上的同源核酸序列。由于核酸分子杂交的 高度特异性及检测方法的高度灵敏性 ,使得核酸分 子杂交技术广泛应用于对环境中微生物的检测 ,定 性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等 研究目标。 DNA标记直接提供了遗传物质的信息 , 因而被广泛应用。以 mRNA为基础的分子标记能更 灵敏地反映污染条件对生物的作用 ,反映变异水平 高。
? 核酸探针技术具有很高的灵敏度和高度的特 异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛 地使用于 克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、
基因组中特定基因序列的定性、定量检测和 疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物 学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上 的应用也日趋增多。
? 在医学上,目前已用于多种遗传性疾病的基因 诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析, 传染病病原体的检测等领域中,其成果大大促 进了现代医学的进步和发展。
核酸探针技术
------ 苗俊杰 庞震
? 定义：能与特定目标核酸序列发生杂交，并 含示踪物的核酸片段(DNA或RNA)。
? 原理：核酸探针技术原理是碱基配对。互补 的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过 程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物 的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的 核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测 核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病 原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标 记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊 断等研究。
核酸探针的应用
? 核酸探针技术是目前分子生物学中应用最 广泛的技术之一，是定性或定量检测特异 RNA或DNA序列的有力工具。核酸探针可用 以检测任何特定病原微生物，并能鉴别密切 相关的毒 (菌)株和寄生虫。目前，各种常见 病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技 术，这方面的研究报道数以万计且与日俱增。 但该项技术的操作毕竟比常规方法复杂，费 用较高。
核酸探针的种类
? 一、按来源及性质划分 ：可将核酸探针分为基因组 DNA探针、 cDNA 探针、 RNA探针和人工合成的寡 核苷酸探针等几类。
? 作为诊断试剂，较常使用的是基因组 DNA探针和 cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备 可通过酶切或聚合酶链反应 (PCR)从基因组中获得 特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随 着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA探针。将 RNA进行反转录，所获得的产物即为 cDNA。cDNA探针适用于 RNA病毒的检测。 cDNA 探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制 备。