白斯古楞论文答辩

DU800紫外分光光度计测定：分别测定细胞 的总RNA光密度值(OD)在260nm和280nm处的, 并计算RNA的含量和纯度。要求 RNAOD260/OD280值在1.5-2.0之间，浓度在 500ug/ml以上的符合实验条件。 RT-PCR半定量方法检测抗癌活性肽（ACBP） 对大肠癌lovo细胞p53、bcl-2、Bcl-xl基 因表达的影响。
用药前和用药24h后（倒置 显微镜下，×100，x400）

细胞总RNA1％琼脂糖电泳
细胞总RNA1％琼脂糖电泳可见清晰的两条条带，分别为 18S和28S。

紫外分光光度计测定： 分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的 光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。 数据显示RNA纯度均在OD260/OD280比值 1.5-2.0之间，浓度在400-2500ug/ml之间， 符合RT-PCR实验条件。

肿瘤是因人体细胞中调控因子的平衡调控 发生紊乱，导致细胞异常增殖而诱发的。 在体内外各种致癌因素的作用下，p53基因 发生缺失或突变，使其编码的蛋白质丧失 了抑制细胞增值的作用，导致细胞的无限 增值而引发肿瘤。变异的p53蛋白不仅丧失 了阻止正常细胞发生癌变的作用，还由于 突变所产生的异常功能(Gain of function) 启动一些原癌基因的过度表达，促进细胞 的恶性转化，加速肿瘤的发生和发展[22.23]。
PCR反应液配制（15ul） 试剂 使用量 5×PrimeSTAR®Buffer（Mg2+ plus） 3.00 μl dNTP Mixture（各2.5 mM） 1.20 μl Primer 1（10 μM） 0.20 μl Primer 2（10 μM） 0.20 μl cDNA产物（10 pg/μl） 3.00 μl PrimeSTAR®HS DNA Polymerase 0.15 μl 灭 菌蒸馏水 up to 15.00 μl

Bcl-2基因家族分为两大类：一类是抗凋亡 蛋白，另一类是促凋亡蛋白[8]。bcl-2、 Bcl-xl属于Bcl-2基因家族成员中抗凋亡蛋 白一类。bcl-2基因能抑制细胞凋亡而延长 细胞的寿命，但不能促进细胞增殖，即细 胞凋亡抑制基因。

Bcl-xl基因是近几年发现的Bcl-2家族成员 的代表，为抑制凋亡的蛋白，在人体各组 织中均有表达[11]。 Bcl-xl功能与bcl-2相 似，能与Bak蛋白一起形成异二聚体，来中 和Bak蛋白的促凋亡作用，从而抑制细胞的 凋亡。

RT-PCR检测p53基因RNA水平表达：
ACBP组与5-FU组p53 基因RNA表达水平明 显低于NS组p53基因 RNA表达。
p53 RT-PCR电泳图

RT-PCR检测bcl-2基因RNA水平表达：
ACBP组与5-FU组 bcl-2基因RNA表达 水平明显低于NS组 p53基因RNA表达。
GAPDH RT-PCR电泳图

大肠癌lovo细胞p53、Bcl-2、Bcl-xl基因 总RNA表达（n=3， ）
组 N S ACBP 别 组 组 p53基因 19.28±0.40 13.23±0.21* bcl-2基因 12.87±0.29 07.28±0.35* Bcl-xl基因 25.81±0.45 17.77±0.47*




实验采用GAPDH片段作为内参照。P53、 bcl-2、Bcl-xl、GAPDH引物采用Oligo 软件进行设计，由invitrogen公司合成。 琼脂糖凝胶电泳 ：取PCR产物5ul，加 5xLoading Buffer 2ul，2%琼脂糖凝胶电 泳 110V，100mA，25min，凝胶成像仪成像 并保存结果。 凝胶图像分析软件半定量分析测定灰度值。




用药24h后倒置显微镜下观察各组lovo细胞 形态学改变。 收集细胞加入1ml的Trizol 提取总RNA 细胞总RNA鉴定：1％的琼脂糖电泳来鉴定 细胞总RNA，观察出现的各个条带及条带亮 度。

总RNA提取步骤：
收集细胞，加入1ml的Trizol 溶解于适量的DEPC水中
冰上放置5min

抗癌活性肽（Anticancer bioactive peptide，ACBP)是一种天然活性物质,相对 分子质量小于800kd，属于小分子多肽 [13,14,15] 。具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免 疫系统的双重作用，大量体外细胞实验和 动物体内试验证明，ACBP能够抑制胃癌， 卵巢癌，鼻咽癌，胆囊癌等多种肿瘤细胞 的DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡和分化，降 低肿瘤患者血液粘稠度，改善微循环，调 节患癌机体无氧糖酵解，提高机体免疫力。
统计学分析

实验数据采用 表示，组间比较采用t 检验，两组以上比较采用方差分析， SPSS13.0 统计软件进行统计学分析。P <0.05 为差异有统计学意义。
实验仪器及设备
分光光度仪
培养箱
显微镜
超净台
低温超速离心机
生理盐水组
实验结果

加入生理盐水24h后 见lovo细胞生长旺 盛,形态良好呈梭形 或多角形，胞质均 匀透明，随时间延 长变化不大。
5-Fu
组
13.82±0.20**
07.88±0.35**
18.29±0.33**
注：*P<0.01，**P<0.01
VS
NS组
讨论

抗癌活性肽(anti—cancer bioactive peptide，ACBP)来源于经过诱导动物脏器， 以现代生物技术分离、提取的一种新型抗 癌生物制剂[19]。在将近十年多的研究中， 目前已经完成了对小白鼠及大白鼠进行的 急毒和长毒试验，表明ACBP对正常的生理 过程及酶的代谢基本上没有干扰，未发现 明显的毒副作用。
用药前和用药24h后（倒置显微镜 下，×100，x400）
5-FU组

加入5-FU 24h后见 lovo细胞数量减少， 部分细胞变小、变 圆、折光率减弱、 核浓缩等细胞凋亡 形态。
用药前和用药24h后（倒置 显微镜下，×100，x400）
抗癌活性肽组

加入ILP 24h后见 lovo细胞数量减少， 部分细胞变小、变 圆、折光率减弱、 核浓缩等细胞凋亡 形态。
作用24h
得出结论
统计学处理
实验方法

体外培养人体大肠癌lovo细胞株 实验分组：将大肠癌lovo细胞株常规复苏, 放入在37℃、5% CO2,饱和湿度的培养箱中 培养。24小时更换DMEM培养基一次,待细胞 融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代,取3-4代 的细胞，分别加入生理盐水( 0.5mL，对照 组)、5-FU ( 0.5mL，阴性对照组) 、抗癌 活性肽( 0.5mL，用药组)

本实验选用25ug/mlACBP对大肠癌lovo细胞 株作用24小时，观察结果可见ACBP其抑癌 作用机制可能与抑制细胞增殖和诱导肿瘤 细胞凋亡有关，以进一步探讨证实ACBP的 抗癌作用机理，并通过RT-PCR方法检测p53、 bcl-2、Bcl-xl基因观察其在肿瘤细胞中的 表达情况，为其在临床应用提供更为完善 的理论依据。
研究目的
• 探讨抗癌活性肽（ACBP）对大肠癌细胞 株的凋亡和p53、bcl-2、Bcl-xl基因表 达的影响，进一步完善抗癌活性肽对大 肠癌细胞的抑制作用机制，证实其对大 肠癌细胞有生长抑制的作用。
实验路线图
体外培养大肠癌lovo细胞
取3-4代的细胞
分为NS、5-FU、 ILP三组
倒置显微镜下观察细胞凋亡 RT--PCR方法检测 p53、l-2 、Bcl-xl 基因的表达
PCR反应条件如下 ： 94 ℃ 5min 1 Cycle 94 ℃ 30sec 52 ℃、53℃或55 ℃* 15sec 25 Cycle 72 ℃ 30sec 72 ℃ 7min 1 Cycle 4℃ 保存 注：p53退火温度为52摄氏度，bcl-2退火温度 为55摄氏度, Bcl-xl退火温度为53摄氏度。


PCR引物详细序列
Sequence(5'to3') Product(bp) p53 F ATGAAGCTCCCAGAATGCCA 264 p53 R AATCAACCCACAGCTGCACA 264 Bcl-xl F CCTGCCTGCCTTTGCCTAA 244 Bcl-xl R TAAACTGACTCCAGCTGTATC 244 bcl-2 F GGTGCCACCTGTGGTCCACCT 261 bcl-2 R CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG 261 GAPDH F CCTCAACGACCACTTTGTCA 103 GAPDH R TTACTCCTTGGAGGCCATGT 103 Tm 52℃ 52℃ 53℃ 53℃ 55℃ 55℃ 50-60℃ 50-60℃

P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高， 研究最广泛、深入的基因之一。p53分为野 生型(wild-type p53,wtp53)和突变型 (mutant-type p53,mtp53）[7] 。野生型 p53 对细胞的分裂和增殖起负调控作用， 是抑癌基因。而p53蛋白由于不稳定，易发 生突变，一旦p53发生突变，就会丧失野生 型p53 基因所具有的细胞周期停滞、诱导 凋亡发生、介导细胞衰老、维持基因稳定 和错配基因修饰等抑癌功能，同时获得许 多癌基因的特殊功能。

bcl-2基因是原癌基因到目前发现的与凋亡 关系最密切的基因之一。正常组织中bcl-2 在自身稳定性方面起着重要作用, 一般在 记忆B淋巴细胞和寿命长的干细胞群及胸腺 髓质细胞里较多，如:结肠、子宫内膜、前 列腺和皮肤中，但在上皮细胞分化末期较 少出现。bcl-2蛋白在正常细胞中可表达于 激活和发育过程，也可表达于成熟组织中， 在人体多种形态的肿瘤细胞中亦可表达， 走向凋亡的细胞中却低表达或不表达[28]。