三乙烯四胺对c-MYC启动子的调节作用解读

三乙烯四胺对c-MYC启动子的调节作用邓小红刘建辉*郑旭煦陈刚郭丽霞(重庆工商大学药物化学与化学生物学研究中心，重庆，400067)摘要目的探讨三乙烯四胺(triethylene tetramine, TETA)对c-MYC启动子的调节作用。

方法构建c-MYC启动子的荧光报告质粒及其突变体，经过序列测定后，转染HEK293细胞24 h后，以终浓度为0 μmol/L, 0.1 μmol/L, 1.0 μmol/L, 10 μmol/L, 100 μmol/L的TETA处理，测定其启动子的转录活性，计算TETA对其转录活性抑制率。

结果成功构建c-MYC启动子荧光报告质粒PGL3-Basic/c-MYC NHE III1promoter及其突变体pGL3-Basci/c-MYC NHEIII1 promoter mutant。

将二者分别转染细胞后发现，TETA可以剂量依赖的抑制c-MYC 启动子的转录活性，而对突变体的转录活性抑制作用明显下降。

结论TETA能通过c-MYC启动子上的超敏元件对其转录活性具有负调节作用。

关键词：TETA；c-MYC启动子；G四链体；转录活性基金项目：国家自然基金(30600813, 30701020)、教育部新世纪优秀人才计划（NCET-07-0913）以及重庆市科委重点基础项目（CSTC, 2005BA5023）的资助。

作者简介:邓小红，女，在读博士*通讯作者: 刘建辉，男，教授，硕士研究生导师Tel: (023) 62769652Email: jhliu@TETA regulates the transcription of c-MYC promoter byenhancing the stability of G-quadruplexDENG Xiao-hong, LIU Jian-hui*, ZHENG Xu-xu, CHEN Gang, GUO Li-xia (Research Center of Pharmaceutical Chemistry & Chemical Biology, Chongqing Technology and Business University, Chongqing, 400067, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To study the effect of triethylene tetramine (TETA) on the transcription of c-MYC promoter. METHODS After the wild and mutant reporter gene plasmids containing the c-MYC NHE III1 sequence were constructed, the two plasmid were transfected into HEK 293 cells. The transfected cells were replated into 96 wells plate, and treated with different concentrations of TETA (0.0 μmol/L, 0.1 μmol/L, 1 μmol/L, 10 μmol/L, 100 μmol/L) for about 6-8h, the luciferase activity was determined with its substrate BrightGlo. The inhibiting rate of TETA on the reporter gene were calculated by the luciferase activity. RESULTS T he luciferase report gene plasmids including pGL3-Basic/c-MYC NHE III1 promoter and its mutant were constructed successfully. And TETA could inhibit the transcription activity of wild reporter gene in a dose-dependent manner, but for the mutated gene, the inhibiting rate was decreased significantly. CONCLUSION TTETA has negative regulatory effect on c-MYC promoter through nuclease hypersensitive element III1.Key words: Triethylene tetramine；c-MYC promoter；G-quadruplex；transcriptionc-MYC是一种重要的转录因子，参与多种生理功能，如在G1/S的过渡、G2/M 的转化中都有作用，与细胞的生长、增殖、分化密切相关。

它同时也是一种重要的原癌基因，位于肿瘤发生、发展的多种信号通路的关键交汇点，其蛋白的表达失调与肿瘤的发生、发展密切相关[1,2]，过量表达将直接或间接导致肿瘤的发生。

研究表明，c-MYC基因的转录85％-90％是由其启动子区的核酸超敏元件III1 (nuclease hypersensitive element III1, NHE III1)所控制[3]。

该元件即为G4-DNA结构，一段富含鸟嘌呤的重复序列，该序列在一定条件下可以形成四链螺旋结构。

该结构在端粒、免疫球蛋白开关区、基因启动子区等许多具有重要生物学功能的基因组中出现。

目前已有多种小分子化合物显示出对G4-DNA的稳定作用，其中包括酰胺蒽醌类化合物[4-7]、卟啉类化合物等[8-10]。

TETA是一种小分子化合物，在中性溶液中带正电，类似于K＋，我们前期通过圆二色谱以及热力曲线证明，TETA在体外能够增强人端粒DNA和c-MYC NHE III1启动子序列形成的G4-DNA结构的稳定性[11, 15]本文将研究TETA在细胞内对c-MYC启动子的调节作用，为TETA 的抗肿瘤作用机制提供实验依据。

1. 实验材料药品和试剂c-MYC启动子质粒Pbv-Del1由美国哈佛医学院Dr. Bert V ogelstein惠赠，限制性内切酶Nhe I和EcoR V购自于TaKaRa公司，c-MYC启动子突变体引物由上海生工合成，突变试剂盒购自于Stratagene公司，Bright- GloTM荧光试剂购自Promega公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen 公司。

HEK293细胞株，购自中国科学院上海生化细胞所。

细胞培养液DMEM、胎牛血清均购自Hyclone公司，TETA购自于Aldrich公司。

2. 方法2.1 c-MYC启动子荧光报告质粒的构建将Pbv-Del 1和PGL3-Basic两种质粒分别都用Nhe I和EcoR V进行双酶切，凝胶电泳后，切胶回收c-MYC启动子2500 bp的片断和酶切后的PGL3-Basic质粒。

将此两种酶切后回收产物按1:5比例在4℃下连接过夜，再将连接产物转化于大肠杆菌DH5α中。

37℃过夜培养，挑取单克隆菌，并提取其质粒后，用Nhe I和EcoR V进行酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的质粒命名为PGL3-Basic/c-MYC promoter。

2.2 c-MYC启动子突变体的构建根据Gene Bank登录号：AC103819 [gi:22539123]中的c-MYC启动子序列，设计突变引物为，上游: ATGGGGAGGGTG A GGAGGGTGGGGAAGGTGGGG，下游:TTCCCCACCCTCC T CACCCTCCCCATAAGCGCC。

根据Stratagene的突变试剂盒说明，首先以PGL3-Basci/c-MYC promoter质粒为模板进行PCR扩增，再将Dpn I酶加入到扩增产物中，37℃作用1 h后直接转化到XL-bule菌，涂板。

37℃过夜培养，挑取单克隆菌，提取质粒后，用Nhe I和EcoR V进行酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的质粒送TaKaRa公司测序，将突变成功的质粒命名为PGL3-Basci/c-MYC promoter mutant。

2.3 TETA对c-MYC启动子的调节作用肿瘤细胞HEK293以1×105/mL接种于6孔板中，待其融合度达到65％～80％时准备转染。

提取的PGL3-Basic/c-MYC promoter和PGL3-Basic/c-MYC promoter mutant两种质粒分别调其浓度为0.5 μg/μL。

将此两种质粒分别与脂质体Lipofectamine 2000混合均匀后，转染于HEK293细胞中，置37℃，5％CO2培养箱中培养24 h后，分别以1×106/mL浓度接种于96孔板，100 μL/孔。

待细胞贴壁后，约2 h－4 h，加入稀释的TETA，使其终浓度分别为：0 μmol/L , 0.1 μmol/L, 1.0 μmol/L, 10 μmol/L, 100 μmol/L，继续培养6-8 h后，Veritas TURNER BIOSYSTEMS上测定细胞的荧光值。

将TETA浓度为0的组设定为control(A)，同批测定其它组的值(X)计算抑制率(I），抑制率(I)＝(A－X）/A×100％，统计分析，采用origin 7.5软件进行。

3. 结果3.1c-MYC启动子荧光报告质粒的构建从Pbv-Del 1质粒上酶切下了c-MYC启动子的全片断，并将其与PGL3-Basic 质粒连接。

经过对单克隆菌株质粒的酶切鉴定，发现从PGL3-Basic酶切下大小为2500 bp的DNA 片断，连接成功的质粒总大小为7300 bp左右，从而构建了c-MYC启片动子荧光报告质粒PGL3- Basic /c-MYC promoter (Fig.1, Fig. 2）。

图1. c-Myc基因结构Fig 1.Structure of c-MYC gene3.2 c-MYC 启动子突变体的构建以pGL3- Basic /c-MYC promoter 为模板进行PCR 定点突变，扩增产物转化XL-bule z 菌，挑取到含有PGL3- Basic /c-MYC promoter 突变位点的质粒，经过测序，发现c-MYC 启动子NHEIII 1的G12→A 突变成功 (Fig. 3)，由此获得了pGL3-Basci/c-MYC promoter mutant 。