实验2 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶2
蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验
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3、 蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜， 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择 确
定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出
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3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg） （ml） （ml）
（ ml）
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶 活力的影响
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酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定(126)
酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其 蛋白质浓度和酶活力测定
蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 :
存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活 力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成 分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式
存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
定。
分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定 一、实验目的
掌握蔗糖酶活力测定方法
二、实验原理
蔗糖酶能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-
糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。每
摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解
速率可以通过斐林试剂法测定还原糖的产生数
量来测定。
蔗糖 葡萄糖
果糖
蔗糖酶
+
斐林试剂法测还原糖含量灵敏度较高，其原理是：
离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液
加热去除热不稳定的杂蛋白
乙醇沉淀获得粗提酶。三、实验材料、仪器和剂 实验材料：安琪酵母
仪器和试剂:
研钵，离心管，滴管，量筒，恒温水浴锅，烧杯， 高速冷冻离心机， pH值试纸 二氧化硅，去离子水，冰，食盐，1mol/L乙酸， 95％乙醇.
四、操作步骤
提取
分转入水相中。
（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min （5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。 （6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。 （7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。 （8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。 （9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0 ml 测定用。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
浙江大学生物化学丙实验报告
. . . . 实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：实验名称： 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验容和原理（1）实验原理 1、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
基质 电荷基团 反离子 电荷基团反离子电荷基团反离子基质基质—＋—＋＋可逆交换可逆交换＋＋溶液中的离子（交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖)— ——阳离子交阴离子交换剂专业： 农业资源与环境姓名： 李佳怡学号： 3130100246 日期： 2015.5.19地点： 生物实验中心310装订线由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。
生化实验报告-离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。
酵母蔗糖酶的提取及其性质研究
改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小 的蛋白质先洗脱下来。
离子交换层析(sephorase DEAE fast flow)
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚 糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白 质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳 离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙 基（Dicthylaminoethyl，DEAE）。在纤维素上结合了 DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14NH+，它的 反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行 交换。 当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂， 如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带 有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO-），其反离子为 阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
利用一定大小孔隙的具有 网状结构的凝胶作层析介 质（如葡聚糖凝胶、琼脂 糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 等），根据被分离物质的 分子大小、形状不同扩散 到凝胶孔隙内的速度不同， 因而通过层析柱的快慢不 同而分离的一种层析法。
离子交换层析
利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力 而分离之
2.装柱与平衡：
先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用 此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近
时即可上样。（一般洗2-3个柱体积）
3.上样与洗脱：
上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M
pH7.3的Tris-HCl缓冲液和30ml含1MNaCl的0.02mol/L
生物化学实验-离子交换层析
1、仪器连接
AB
开关
A、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓
冲液
B、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（0.5
mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 1.接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置
A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶
液。1：缓冲液阀（Buffer valve） 2. 点2：击混电和脑器桌（面M上ixUenri）corn软件图标，打 开软3：件样。品选阀择（SySsatemmplCeovnatrlovel ，）点击OK ，进4：入泵操（作P界u面m。p）点击Connect 3. 在5：操压作力界传面感的器工（具P栏re，ss点u击reMannual Rusne。n出so现r）FlowRate 窗口，调节flowrate 为 61：ml清/m洗in，阀确（定Wa。sh valve）
Wash valve Collector
（1）连接混和器及样品阀，流速调整为1.0ml/min （2）切换至BufferB，直至Conductivity到达40mS/cm （3）连通BufferA，直至Conductivity接近2并平稳 ，准备装柱
3、装柱和平衡： （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（mixer) 相连，下端接头与样品阀（sample valve)相连。
实验器材与仪器
1、高速冷冻离心机 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组） 3、ÄKTATM start（1套/组） 4、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） 5、－20℃冰箱（保存样品用） 6、微量移液枪 200ul、1000ul 7、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） 8、7ml离心管（留样品Ⅳ用） 9、恒温水浴（50℃、100℃） 10、试管、移液管、试管架等
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四、实验器材与仪器 1、高速冷冻离心机； 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）； 3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1台/组）； 4、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）； 5、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组） ； 6、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（1台/组） ； 7、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） ； 8、铁架台、夹子 （固定层析柱用）（1套/组） ； 9、－20℃冰箱（保存样品用）； 10、微量移液枪 200ul、1000ul； 11、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）； 12、7ml离心管（留样品Ⅳ用） ； 13、恒温水浴（ 50℃、100℃）； 14、试管、移液管、试管架等。
蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。 它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的 葡萄糖和果糖（还原糖），（50℃水解） 。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热（100℃）被还原成棕红色的氨基化合物， 在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5－二 硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖 酶纯化样品。
三、实验材料与试剂 1、实验材料
蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ⑴ DEAE-Sepharose（琼脂糖0mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液； ⑶ 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液(学生自配）； ⑷ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ； ⑸ 5%蔗糖溶液 ； ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂
2
1
梯度混合器
层析柱（φ1.0×20㎝ ） DEAE- Sepharose Fast Flow
恒流泵 核酸蛋白检测仪 记录仪
部分收集器
1、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液 2、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（ 1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml, 在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入 800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.
甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后 使用。
3、纯化检测仪器（系统）连接： 将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝ ），恒流泵 (10rpm)
（流速0.8～1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速： 0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5 ml/管/5min）等按下图连接并 设置好。
纯化检测仪器（系统）连接示意图
实验二
离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）
离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据 流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的 差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中 离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶 液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有 区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的 电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱 逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
固定相…………..基质 电荷基团
阳离子交换剂
基质
— 电荷基团
阴离子交换剂
基质
＋
电荷基团
反离子
＋
流动相
＋ ＋ 可逆交换 ＋
反离子
溶液中的离子 或离子化合物
—
可逆交换
—
—
—
反离子
溶液中的离子 或离子化合物
由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品 蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸 附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的 电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强 弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测）
五、实验操作方法和步骤 1、离子交换剂准备：(实验室已准备好）
DEAE—Sephadex， 取适量DEAE—Sephadex，加入0.5mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水 洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸 泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡 备用。
DEAE- Sepharose Fast Flow， （ 按说明书处理）
2、样品处理： 将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于15ml 20mmol/L Tris-HCl
pH7.3 缓冲液；4℃ 15000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ） 测量总体积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活 力的测定以及用于SDS-PAGE分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析 进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。