大赛璐手性分析方法筛选与优化分析
大赛璐手性柱使用注意事项
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Part. 1-5
正相柱的冲洗与保存
实验完成后：如流动相中有酸性或碱性添加剂，先用不加添加剂的同 比例流动相冲洗柱子（20倍柱体积），再用出厂保存溶剂冲洗保存（ 20倍柱体积）。比如ADH柱实验用的流动相是正己烷：乙醇：二乙 胺=70:30:0.1，用完了以后先用正己烷：乙醇=70:30冲洗，最后用正 己烷：异丙醇=90:10冲洗保存。 柱子被污染：按照大赛璐《多糖涂覆型手性柱（正相流动相）冲洗方 法》进行冲洗 注意：醇的黏度大，注意冲洗时的流速； AYH不可以用100%异丙醇冲洗，否则柱效会下降，但这种损 伤是可修复的，用乙醇将异丙醇从柱子中置换出来即可恢复柱效。
B.仪器当前流动相中含有一些会破坏柱子的溶剂（如乙酸乙酯、二氯甲烷和四氢呋喃等） ，仪器先不接柱子，接上两通
1. 用异丙醇或乙醇冲洗所有管路 （至少60ml） -> 置换掉对柱子有损伤的溶剂 2. 用实验所需流动相冲洗所有管路（约30ml） -> 置换醇 C.仪器当前流动相是传统的非水流动相（如正己烷、异丙醇和乙醇），仪器先不接柱子， 接上两通，直接用实验所需流动相冲洗所有管路（约30ml）即可
CHIRALPAK® AD-3/AD-H/AD CHIRALPAK® AS-3/AS-H/AS CHIRALPAK® AY-3/AY-H CHIRALPAK® AZ-3/AZ-H CHIRALCEL® OD-3/OD-H/OD CHIRALCEL® OJ-3/OJ-H/OJ CHIRALCEL® OZ-3/OZ-H CHIRALCEL® OX-3/OX-H CHIRALCEL® OB-H/OB CHIRALCEL® OC-H/OC CHIRALCEL® OA CHIRALCEL® OG CHIRALCEL® OF CHIRALCEL® OK
大赛璐柱子使用
1、OD柱与ODH柱是不是一种柱子啊，另外还有AD与ADH，OJ与OJH关于手性柱，OD柱与ODH柱是不是一种柱子啊？OD柱与ODH柱是不是一种柱子啊，另外还有AD与ADH，OJ与OJH，谢了柱子的型号不同说明他的手性填充物不同。
OD和OD－H的区别是相同的填充物，OD－H的填充密度大，更紧，效果更好。
CHIRALPAK AD-H柱和CHIRALPAK AD是什么区别？CHIRALPAK AD-H柱和CHIRALPAK AD的填料种类是一样的，表面涂敷的都是直链淀粉－三(3,5－二甲苯基氨基甲酸酯)，手性选择性基本相同。
只不过填料的粒径不一样，CHIRALPAK AD-H是5 μm，CHIRALPAK AD是10 μm。
CHIRALPAK AD-H能代替CHIRALPAK AD并且CHIRALPAK AD-H柱效更高。
2.手性柱谱图中异构体的分离度下降了，这可能是什么原因，该怎么办？分离度下降的原因有可能是色谱柱以外的色谱条件发生了变化，或者色谱柱受损柱效发生了变化。
首先查看是否是因为温度、流动相成分等外在因素发生了变化导致分离度下降，如果排除了各种外在因素就有可能是分析柱本身的柱效下降导致的。
如果分离度在短时间内急剧下降伴随柱压上升，可能是有强极性溶剂损害了柱子；如果分离度在长时间内慢慢下降，可能是柱头受污染或柱头塌陷，需要更换保护柱或者更换分析柱。
3.正相手性色谱柱柱压高了怎么办？手性柱压力高的原因有可能是流动相中醇的含量太高，或者液相流路中有堵塞，或者柱头有样品析出，或者填料被压缩柱头塌陷等。
针对不同的原因请有针对性的采取相应的措施。
如果是流动相中醇含量太高，则需要升高温度或者降低流速。
如果液相流路中有堵塞需要排除堵塞。
如果柱头有样品析出则需要使用流动相溶解样品以及样品预处理除掉样品中易析出的成分。
如果填料被高压压缩柱头塌陷，则需要重新购买新的手性柱。
4.正相手性柱进了水后，柱子会不会损坏？正相手性色谱柱AD-H、AS-H、OD-H、OJ-H一旦进了水，柱压会升高，但是只要柱压不超过柱压上限，柱子就不会损坏。
大赛路手性柱Q&A及手性分离经验
优化手性化合物的分离方法时，如何增加分离选择性？正相手性色谱柱上增加分离度的方法有：降低流动相中醇的含量、降低柱温、更换流动相中醇的种类、更换手性柱。
建立手性化合物的分离方法时，选定了正相手性柱之后，如何选择流动相？流动相首选正己烷和异丙醇的混合溶液，根据样品的酸碱性决定是否添加酸碱性添加剂。
如果是中性样品则不需要添加添加剂，如果是酸性样品需要添加三氟乙酸或乙酸，如果是碱性样品需要添加二乙胺，添加剂的量一般为0.1 %。
流动相中醇的含量一开始可以使用30%，根据样品出峰的快慢和分离度再调整醇的含量。
流动相中醇的种类一般使用异丙醇，也可以使用乙醇。
建立手性化合物的分离方法时，如何选择手性柱？根据文献或者参考大赛璐公司的《应用指南》中结构类似物的分离方法，选择手性柱；另外可以寄少量消旋品，大赛璐公司能免费为您选择分离最佳的手性柱。
手性柱使用完了之后如何清洗保存？正相手性色谱柱如果使用正己烷和醇类的混合流动相之后，只需要用正己烷/异丙醇=90/10(v/v)的保存溶液冲洗30 min即可。
反相手性色谱柱如果使用了水溶液和乙腈的混合流动相之后，只需要用水/乙腈=70/30(v/v)的保存溶液冲洗30 min即可。
CROWNPAK® CR(+)柱流动相中甲醇含量有要求吗？CROWNPAK® CR(+)柱流动相中甲醇含量为0％-15%，甲醇的含量一旦超过15%，CROWNPAK® CR(+)柱会被损害。
正相手性柱进了水后，柱子会不会损坏？正相手性色谱柱（例如AD-H、AS-H、OD-H、OJ-H）一旦进了水，柱压会升高，但是只要柱压不超过柱压上限，柱子就不会损坏。
只需用无水乙醇低流速(0.1-0.2 ml/min)将水全部充分置换出来，再用正相流动相低流速(0.1-0.2 ml/min)将乙醇全部置换出来就能继续使用该正相手性色谱柱。
样品的保留时间漂移，可能是哪些原因，如何解决？1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定。
手性分析之经验谈
手性分析经验谈关于手性化合物、手性分析、手性填料和手性柱，现在的理论很多，讲的也比较复杂，我看了很多也不是特别明白，做分析三年多，分过的手性化合物最少也有几千种，拿到手里的消旋体几乎没有分不开的，没用到什么理论，主要都是经验，这里还是拣最实用的来讲。
手性分析可以使用普通的色谱柱，需要流动相中添加手性分离试剂，也可以直接用固定相为手性填料的手性色谱柱，前者使用较少，大家更多的是使用商品化的手性色谱柱。
手性分析包括气相和液相两种，这个主要和样品的物理性质有关系，现在的手性化合物绝大多数都不能做气相，所以气相手性色谱柱无论从数量还是质量上来讲都不能与液相手性色谱柱相提并论。
一、手性柱手性分离最重要的是选择一根好的手性柱，说到手性柱就不得不提大赛璐，做手性分析的都知道，大赛璐的手性柱目前市场占有率最高，大家最熟悉的可能是OD- H，很多文献中都有报道。
大赛璐公司最初有四种填料，结构类似，对应的色谱柱分别是OD、AD、OJ和AS，粒径10um，后来填料粒径变为5um，就是卖的最多、使用范围最广的柱子，号称四大金刚，分别是OD-H、AD-H、OJ-H和AS-H，在柱子名称后边加“-H”，意思应该是高效，这些柱子都只能做正相使用，为了在反相色谱中使用开发的柱子在相应的色谱柱名称中添加了一个“R”，上述色谱柱都属于涂覆型填料，不耐溶剂，使用起来受样品溶解性的限制，最近又开发了键合相手性柱，可以使用几乎所有的常见溶剂做流动相，新的溶剂还提供了新的选择性，进而提升了色谱柱的分离能力，主要是IA、I B和IC，其中IA对应AD-H，IB对应OD-H，IC是新开发的填料。
和反相柱的发展趋势一样，大赛璐的手性柱也通过减小粒径来获得更高的柱效，最新的手性柱填料粒径是3um。
另外大赛璐还有其它一些手性色谱柱，但是远不及上述几种。
关于大赛璐手性柱的详细资料官方网站上讲的很详细，大家有兴趣可以去看，这里主要讲我的使用经验。
最近大赛璐公司的销售和技术曾经来过我们公司做讲座，因为我们先后买了他们三四十只手性柱，一直是自己摸索着使用，理论上的东西懂得很少，非常希望专家的能给我们提供指导，提升我们的技术水平，这个讲座的ppt网上流传的很多，对初学者来讲确实非常不错，但是专家的水平让我们实在不敢恭维。
手性药物拆分技术及分析
手性药物拆分技术及分析在药物研究和开发中，手性药物是一个非常重要的领域。
手性药物指的是分子结构中含有手性中心（手性碳原子）的化合物，左旋和右旋两种异构体具有不同的生物活性和体内代谢途径。
因此，正确地分析和分离手性药物对于药物研究和有效性的评估至关重要。
手性药物分析技术主要包括色谱法、光学活性法和核磁共振（NMR）法。
色谱法是一种常用的手性药物分析方法。
它基于手性药物的两种对映异构体在手性固定相上的不同吸附能力进行分离。
常见的色谱法包括高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法。
HPLC通常使用手性固定相柱，通过选择性地吸附左旋或右旋手性分子，实现对手性药物的分离。
毛细管电泳是一种高效的手性药物分析方法，基于对映异构体在电场中的迁移速率不同，通过毛细管中背景电解质的浓度和pH值调节来分离手性药物。
光学活性法是一种基于光学活性性质来分析和测定手性药物的方法。
光学活性手性药物由于具有旋光性，可以引起光的偏振方向发生旋转。
常用的光学活性法包括旋光仪法和圆二色光谱法。
旋光仪法是通过测定手性分子对光的旋转角度来判断手性药物的对映异构体的含量和比例。
圆二色光谱法则是测量手性分子对不同波长光的吸收性质，通过对波长的差异来判断手性药物的对映异构体。
核磁共振（NMR）是一种基于核磁共振现象来分析手性药物的方法。
NMR技术通过检测手性碳原子或核自旋的信号来确定手性药物的结构和对映异构体的比例。
通过对样品进行核磁共振实验后，通过解释谱图的峰位和峰形等信息，可以得到手性药物的分析结果。
此外，还有一些其他的手性药物分析方法，如质谱法、X射线衍射法和环光谱法等。
这些方法在手性药物分析中各有优劣，适用于不同类别和性质的手性药物。
总之，手性药物分析技术对于药物研究和评估的重要性不可忽视。
科学家们通过不断研究和发展新的手性分析技术，为新药开发和治疗提供了更可靠和准确的手性药物分析方法。
手性色谱分析
2022/1/16
第34页，共49页。
• 环糊精类（包容色谱 ）
D-葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接的环状分 子结构 ，其疏水性内腔的包容作用和腔外上的羟基 与药物对映体的氢键作用是手性识别的基础。
有α、β、γ三种类型，其中β环糊精及其衍生物 应用范围最为广泛。
环糊精手性固定相与流动相
• 流动相添加环糊精法拆分时，与流动相中环糊精包合越 好的对映体，随流动相较快地被洗脱；
• 环糊精固定相拆分时，与固定相中环糊精包合越好的 对映体易被固定相所保留，较慢地被洗脱。
• 以环糊精流动相分离对映体的洗脱顺序与环糊精固定 相拆分的顺序刚好相反。
2022/1/16
第38页，共49页。
纤维素-三[3,5-二甲苯基氨基甲酸酯]衍生物； CHIRALCEL 适用于分离β-受体阻滞剂、具有相同功能的化
OD系列 合物、类固醇类化合物，如：阿普罗尔、美托 洛尔、氧烯洛尔。（芳氧丙醇胺类）
CHIRALCEL
OJ系列
纤维素-三[4-甲基苯甲酸酯]衍生物； 被用于分离布洛芬、氯胺酮等药物，以及在手 性中心含有一个大的取代基的化合物
R2
• 在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二 氯甲烷或DMF中进行。
2022/1/16
第16页，共49页。
色谱分离和前处理条件优化
• 流动相组成和流动相pH对拆分的影响
（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；
（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。
• 衍生化时间及GITC用量的优化
（1）反应时间：10 min ~ 30 min
min ~ 30 min，进样分析。
2022/1/16
大赛璐手性柱Chiralpak AD-H使用手册
n 烷烃：正己烷，异己烷或正戊烷，不同的烷烃有不同的选择性。
o
流动相中异丙醇换成乙醇，样品的保留时间缩短。 流动相中醇含量增加，样品的保留时间缩短。 可以使用正丙醇，正丁醇，异丁醇等醇类，但选择性会有差别。
p 甲醇在烷烃中的溶解性不好，正己烷中甲醇的最大含量是 5％。如果要在烷烃中加入甲醇，最好同时加入一定量的乙醇。
) 清洗色谱柱可以用无水乙醇以适当的流速冲洗 3 个小时（适用于应用烷烃/醇类流动相的色谱柱）。
注意事项：
Ö 不能使用强碱性物质作为流动相添加剂或者溶解样品，因为这样会损坏填料中的硅胶成分。 Ö 本《操作手册》不适用于其他种类的色谱柱。 Ö 如果您在使用过程有任何疑问，请与我们联系。 严格遵照本《使用手册》，可延长色谱柱的使用寿命。
E-mail：china.hplc@
CHIRALCEL®, CHIRALPAK® and CROWNPAK® 是大赛璐化学工业有限公司的注册商标
4
250 x 10mm ID 5.0 to 7.0 ml/min 2.0 to 3.0 ml/min
1.0 ml/min
250 x 20mm ID 18 to 25 ml/min 5.0 to 8.0 ml/min 3.0 to 5.0 ml/min
1
d
柱压指色谱柱压降，即接上柱子后系统的压力与未接柱子时系统压力的差值。
q 选择醇类流动相的配比时，建议可用甲醇/乙醇 50：50（v/v）最为初始流动相。
r CHIRALPAK® AD-H柱能使用 100％的甲醇或乙腈，然而一旦使用了这类极性流动相，就只能一直使用极性流动相。
如果要将正己烷换成甲醇或乙腈，或者要换成不同的极性溶剂，强烈建议使用 100％的异丙醇作为过渡溶剂，过渡流速小一 些（异丙醇粘度较大）。
大赛璐键合手性柱使用指南
一、键合手性柱简介多糖涂敷型手性柱，如CHIRALPAK®AD-H/CHIRALPAK®AS-H/CHIRALCEL®OD-H/CHIRALCEL®OJ-H等，其涂敷在硅胶表面上的各种衍生物有可能被一些有机溶剂溶解或溶胀。
因此，可用作流动相组分及样品溶解液的溶剂非常有限。
通过化学键合的方法将多糖衍生物固定在硅胶表面而制得的键合型手性固定相，即可克服涂敷型手性固定相的不足之处。
为了满足市场的需求，大赛璐公司凭借多年的研究成果和独有的技术，已推出了新一代化学键合型手性色谱柱系列：CHIRALPAK®IA，CHIRALPAK®IB和CHIRALPAK®IC。
CHIRALPAK®IA是将淀粉-3,5-二甲苯基氨基甲酸酯键合在硅胶表面（5 µm），相应的涂敷型色谱柱是CHIRALPAK®AD （CHIRALPAK®AD-H）；CHIRALPAK®IB 是将纤维素-3,5-二甲苯基氨基甲酸酯键合在硅胶表面（5 µM）, 相应的涂敷型色谱柱是CHIRALCEL®OD （CHIRALCEL®OD-H）；CHIRALPAK®IC将纤维素-3,5-二氯苯基氨基甲酸酯键合在硅胶表面（5 µM）（注意：相应的涂敷型色谱柱没有商品化）。
其化学结构式如下图所示。
新一代化学键合型手性柱具有下列特点：·通用于所有液相色谱流动相·新分离选择性·样品溶解液没有任何限制·高柱效高分离性能·柱寿命长，可再生·操作方便，简单，灵活新一代共价键合手性柱不仅可以使用那些常用在涂敷型手性柱上的流动相体系，如烷烃/醇类，更为重要的是还适用于诸如乙酸乙酯、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、三氯甲烷等这些不适宜用在涂敷型手性柱上的溶剂。
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流动相 Hex/IPA=90/10
Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1
碱性 样品
N
H2N
N
O
流动相
mV
mV 10.74
13.96
0.40
7.0
10.94
0.35
0.30
（无法分离 )
6.0
0.25
5.0
0.20
4.0
0.15
3.0
0.10 2.0
0.05
0.00
1.0
-0.05
0.0
-0.10
12.005 15.046
29.879
0
0.0
5.0
mV Detector A Ch1:220nm
125
3000
2000
2000
1000
1000
0
0
0
5
10
15
Minutes
Column: AY-H (4.6*150mm) Temp: 35℃ Flow:2.0ML/MIN Mobile phase: CO2/IPA/DEA
=85/15/0.1
Column: AY-H (4.6*150mm) Temp: 35℃ Flow:1.2ML/MIN Mobile phase: CO2/IPA/1-propylamine =85/15/0.1
气相色谱 （GC）
模拟移动床 (SMB)
手性色谱技术
逆流色谱 （CCC）
色谱法
薄层色谱 （TLC）
高效液相色谱 （HPLC）
大赛璐手性分析方法筛选与优化分析
超临界 (SFC)
对映体纯度测定方法及其比较
方法 旋光法
精度 低 (5%)
样品用量 几十毫克
说明 需要真实样品
非对映体异构体法 ＮＭＲ 色谱法
纤维素衍生物 CHIRALCEL® OD / OD-H/OD-3 CHIRALCEL® OJ / OJ –H/OJ-3 CHIRALCEL® OZ –H /OZ-3 CHIRALCEL® OA, OB, OC CHIRALCEL® OF, OG, OK CHIRALCEL® CA-1
反相
CHIRALPAK® AD -RH/AD-3R
其它 Chiral -AGP ® CROWNPAK® CR (＋), (－)
CHIRALPAK® OT(＋), OP (＋) CHIRALPAK® WH, MA (＋) CHIRALPAK ® QD-AX CHIRALPAK ® QN-AX
大赛璐固定相： USP\EP\中国药典
涂布型正相手性柱：
添加物的种类和用量
样品酸碱性 中性
碱性
添加物种类
不需要 二乙胺 (DEA)
(n-丁胺*1) (乙醇胺*2)
酸性
三氟乙酸 (TFA) 醋酸
*1 主要用于1级胺 *2 主要用于1级氨基醇
添加量
≦0.5％ 通常0.1％
≦0.5％ 通常0.1％
不同添加剂对手性分离的影响
mv
mv 12.240
14.853 mv
对于一些特殊的样品：酸碱添加剂同时添加，优化分离
2.225
mV Detector A Ch1:220nm
400
300
200
100
Column: OZ-H (4.6*150mm) Temp: 35℃ Flow: 1.0 ml/min
Mobile phase:hexane/IPA/DEA(75/25/0.1)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Minutes
Minutes
流量：1.0mi/min. 温度：25℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ）
Hex/IPA=90/10
Hex/IPA/DEA=90/10/0.1
业界之最 享誉全球
主要内容
手性色谱基础和大赛璐手性柱 涂布型正相手性分析方法开发 涂布型反相手性分析方法开发 化学键合型手性分析方法开发 常见手性分析问题与注意事项
液-液萃取法
手性色谱技术
生物催化法 不对称合成法
膜分离法
传感器法
手性分离方法
结晶法
毛细管电泳
色谱法
大赛璐手性分析方法筛选与优化分析
• 操作简单 • 不需要预处理 • 准确度高
引入手性环境 是实现手性分
离的前提
即可用于对映体的常规分 析，也可实现大规模制备
R
R
R
大赛璐手性分析方法筛选与优化分析
Daicel手性色谱柱一览表
正相
直链淀粉衍生物 CHIRALPAK® AD / AD-H/AD-3 CHIRALPAK® AS / AS-H/AS-3 CHIRALPAK® AY-H/AY-3 CHIRALPAK® AZ-H/AZ-3
高 (0.1%)
中等 (2%) 高 (0.1%)
需要其它的.手性化合 几十毫克 物来制备非对映体
几毫克 微克-毫克
需要位移试剂. HPLC、GC、SFC
大赛璐手性分析方法筛选与优化分析
手性色谱固ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ相法基本原理
对映体分离 示意图
R SR SR S
手
性 选
S S
SS SS
SS
择
剂
RR RR
R
R,S 消旋体 (racemate)
CHIRALPAK® AS –RH/AS-3R
CHIRALCEL® OD-RH/OD-3R
CHIRALCEL® OJ –RH/OJ-3R
CHIRALPAK® AY –RH/AY-3R CHIRALCEL® OZ –RH/OZ-3R
共价键合型
CHIRALPAK® IA/IA-3 CHIRALPAK® IB/IB-3 CHIRALPAK® IC/IC-3
mV
1.0
0.8
0.6
F 0.4
0.2
35
（没出峰 )
30
25
20
15
10
5
0.0
COOH
0
5
10 15 20 25 30 35 40
Minutes
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Minutes
流量：1.0mi/min.温度：40℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ）
手性分析方法的建立和优化
分析条件优化流程图 (1)
1. 确认流动相中是否使用酸、碱添加剂
酸性
样品
中性
Hex/IPA/TFA =70/30/0.1
Hex/IPA =70/30
碱性
Hex/IPA/DEA =70/30/0.1
配制流动相
添加物在分离中的作用
mV 6.66
7.52
1.6
酸性
1.4
1.2
样品
mv
1200
1: 220 nm, 4 nm Retention Time
1000
800
600
400
200
0
1200 1000 800 600 400 200 0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Minutes
1: 220 nm, 4 nm
3000 Retention Time