色谱分离技术
合集下载
第七章 色谱分离技术
固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
色谱分离技术
二、离子交换树脂的性能 1. 交联度（degree of cross linking）： 离子交换 交联度（ ）： 树脂上胶联剂的含量称为交联度。 树脂上胶联剂的含量称为交联度。交联度用重量百分 比表示， 标号树脂， 比表示，如“×4”标号树脂，其交联度为 标号树脂 其交联度为4%。应根据 。 试样性质进行选择。 试样性质进行选择。 2.交换容量：每千克干树脂能参加交换反应的活 交换容量： 交换容量 性基团数， 表示。 性基团数，用mmol/g or mmol/ml表示。 表示 粒度：离子交换树脂颗粒的大小， 粒度：离子交换树脂颗粒的大小，用树脂溶胀态 所能通过的筛孔数表示。 所能通过的筛孔数表示。 三、流动相 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。有酸 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的pH， 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的 ，缓冲液的 类型，离子强度， 类型，离子强度，以及加入的有机溶剂都会影响组分 的分离。 的分离。
二、纸色谱法 （一）基本原理 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法。 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法 。 固定相 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺、缓冲液等。 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺 、 缓冲液等 。 流动 相为与水不相混溶的有机溶剂。 相为与水不相混溶的有机溶剂 。 因为吸附在纤维上 20%的水分中，有约 的水分中， 的水分中 有约6%可通过氢键与纸纤维素上的羟 可通过氢键与纸纤维素上的羟 基结合生成复合物，与亲水性溶剂可形成两相。 基结合生成复合物 ， 与亲水性溶剂可形成两相 。 纸色 谱法属分配色谱， 谱法属分配色谱 ， 是利用样品组分在两相间分配系数 的不同达到分离的目的。实际上，纸色谱的分离机制 的不同达到分离的目的。 实际上， 较复杂，除分配外， 较复杂 ， 除分配外 ， 可能还有溶质与纸纤维素间的吸 附作用，与纸纤维素上某些基团（ 附作用 ， 与纸纤维素上某些基团 （ 造纸时引入到纤维 素上的）之间的离子交换作用。 素上的）之间的离子交换作用。
第7章 色谱分离技术
(4) 酚-醛型树脂 主要由水杨酸、苯酚和甲醛 缩聚而成，水杨酸和甲醛形成线状结构，苯酚作 为交联剂。
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。
(1) 强酸性阳离子交换树脂
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为： 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
第7章 色谱分离技术
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一 相（一般是气体或液体）称为流动相 。
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂
吸附剂的选择
一般地说，所选的吸附剂应有最大的比 表面积和足够的吸附能力，它对欲分离 的不同物质应该有不同的解吸能力；与 洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学 反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀， 在操作过程中不会破裂。
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。
(1) 强酸性阳离子交换树脂
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为： 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
第7章 色谱分离技术
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一 相（一般是气体或液体）称为流动相 。
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂
吸附剂的选择
一般地说，所选的吸附剂应有最大的比 表面积和足够的吸附能力，它对欲分离 的不同物质应该有不同的解吸能力；与 洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学 反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀， 在操作过程中不会破裂。
生化分离工程4.色谱分离
Willstätter（1915年获诺贝尔化学奖获得者）1913年 在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是一种 “离奇的方法”，认为它不适用于制备工作，在吸 附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写道： “色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎不适 合于制备目的……”
Willstätter的观点，即过分强调制备工作，也反映出 当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的
吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化 学吸附作用。物理吸附的特点是选择性低，吸 附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点 是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。 物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条 件下也可以互相转化。
吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的 一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸 附剂。
凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透 色谱（gel permeation chromatography， GPC） 。
பைடு நூலகம்
电色谱
电色谱（electrochromatography）是电泳和液 相色谱的融合技术。所谓电色谱是采用电渗流 来推动流动相，使得峰扩展只与溶质扩散系数 有关，因而使电色谱的理论塔板数远远高于液 相色谱。同时由于引入了高效液相色谱的固定 相，使电色谱具备了高效液相色谱固定相所具 有的选择性，使它不仅能分离带电物质。也能 分离中性化合物。
1935年，Adams和Holmes 合成了离子交换树 脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色 谱法。
1941年A. J. P. Martin和R. L. M. Synge发明了 分配色谱法（partition chromatography）。 1952年获诺贝尔化学奖。
Willstätter的观点，即过分强调制备工作，也反映出 当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的
吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化 学吸附作用。物理吸附的特点是选择性低，吸 附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点 是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。 物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条 件下也可以互相转化。
吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的 一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸 附剂。
凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透 色谱（gel permeation chromatography， GPC） 。
பைடு நூலகம்
电色谱
电色谱（electrochromatography）是电泳和液 相色谱的融合技术。所谓电色谱是采用电渗流 来推动流动相，使得峰扩展只与溶质扩散系数 有关，因而使电色谱的理论塔板数远远高于液 相色谱。同时由于引入了高效液相色谱的固定 相，使电色谱具备了高效液相色谱固定相所具 有的选择性，使它不仅能分离带电物质。也能 分离中性化合物。
1935年，Adams和Holmes 合成了离子交换树 脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色 谱法。
1941年A. J. P. Martin和R. L. M. Synge发明了 分配色谱法（partition chromatography）。 1952年获诺贝尔化学奖。
色谱分离技术及其应用
色谱分离技术及其应用色谱分离技术是指利用固定相和流动相间的相互作用，在物质混合物中将各种组分分离开的技术。
色谱分离技术已成为分离、检测和分析生物、化学和环境样品中物质的重要工具。
色谱分离技术的基本原理是将混合物分离成若干性质相近或相同，但成分不同的组分。
这是通过固定相和流动相的相互作用来实现的。
在固定相和流动相的相互作用中，固定相可以是一种具有表面活性、具有亲疏水性、或化学亲和作用的材料。
而流动相则可以是一种液体或气体，它们可以通过了固定相，使得混合物中的组分在固定相上吸附或溶解，从而实现各组分的分离。
色谱分离技术在生物、化学和环境科学等领域应用广泛。
例如，在生物学和医学中，在基因显微分析、捕获蛋白质、酶和细胞的单细胞检测中，广泛采用了色谱分离技术。
此外，还可以用于药物筛选、质量控制和制造的过程控制。
在环境领域，色谱分离技术可用于寻找化学毒物和环境污染物，并对环境废物进行检测和处理。
高效液相色谱（HPLC）是最常用的色谱分离技术之一，它可以处理各种类型的混合物，并对具有取向和激发导向性分子进行分离。
在HPLC分离中，利用固定相与流动相间的相互作用来移动样品混合物。
固定相一般是一种高度纯化的压缩载体，使得各个样品成分分离时可以得到更高的纯度。
而流动相一般应适合所需要分离的物质类型。
在汽相色谱（GC）中，气相与液相的相互作用，使得分子在流动相中具有更高的活性和协同性。
此外，它还可以用于食品质量检测中。
例如，气相色谱技术常用于检测食品中的农药、有机物和污染物。
而在高效液相色谱技术中，可以利用蛋白质和植物次生物质进行分离，用于食品中的物质鉴定和质量评估。
总之，色谱分离技术已成为一个广泛应用的分析和分离技术。
随着科技的不断进步，色谱分离技术将更好地应用于各个领域的分析和分离中，为人类的健康和环境保证做出重要贡献。
色谱分离技术
主要内容
▪ 色谱分离技术概述 色谱技术的基本概念 色谱技术的理论基础 色谱法的分类 色谱技术的操作方法
▪ 吸附色谱法 ▪ 分配色谱法 ▪ 亲和色谱法
第一节 色谱分离技术概要
色谱技术的起源: ▪ 1903年Tswett首创 ▪ 叶绿素的石油醚溶液通过碳酸钙管柱,
并继续以石油醚淋洗,由于碳酸钙对叶 绿素中各种色素的吸附能力不同,色素 被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色 的谱带。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
色谱技术的发展
分离对象： 不限于有色物质
色谱柱： 材料：玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯
形状：直形、U形、螺旋形
二维平面形（纸、薄层色谱）
冲洗剂： 液体、气体
填料：
近千种 固体、液体
检测：
眼睛、各种检测器
操作：
手工 全自动 联用技术
气相色谱（1952年）
1-载气钢瓶； 2-减压阀；
3-净化干燥管；
4-针形阀；
▪ 加入洗脱剂使各组分分层的操作称为展开。 ▪ 洗脱时从柱中流出的液体称为洗脱液。 ▪ 展开后各组分的分布情况称为色谱图。 ▪ 将样品加到柱上的操作称为上样或加样。
A+B+C
信 号
ACB C B A
C
B
C
A
B
C
A
B
C
图11-1 色谱洗脱过程与色谱图
t，min
（一）固定相 ▪ 可以是固体物质（吸附剂，凝胶，离子交换剂），也可以
（三）分配系数，分配比和选择因子
▪ 1、分配系数：在一定条件下，某种组分在固定相和流 动相中含量（浓度）的比值。它是色谱中分离纯化物质 的主要依据。langmuir
▪ 无论色谱分离的机理如何，当溶质浓度较低时，固定相 浓度和流动相浓度成线性的平衡关系。
▪ 色谱分离技术概述 色谱技术的基本概念 色谱技术的理论基础 色谱法的分类 色谱技术的操作方法
▪ 吸附色谱法 ▪ 分配色谱法 ▪ 亲和色谱法
第一节 色谱分离技术概要
色谱技术的起源: ▪ 1903年Tswett首创 ▪ 叶绿素的石油醚溶液通过碳酸钙管柱,
并继续以石油醚淋洗,由于碳酸钙对叶 绿素中各种色素的吸附能力不同,色素 被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色 的谱带。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
色谱技术的发展
分离对象： 不限于有色物质
色谱柱： 材料：玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯
形状：直形、U形、螺旋形
二维平面形（纸、薄层色谱）
冲洗剂： 液体、气体
填料：
近千种 固体、液体
检测：
眼睛、各种检测器
操作：
手工 全自动 联用技术
气相色谱（1952年）
1-载气钢瓶； 2-减压阀；
3-净化干燥管；
4-针形阀；
▪ 加入洗脱剂使各组分分层的操作称为展开。 ▪ 洗脱时从柱中流出的液体称为洗脱液。 ▪ 展开后各组分的分布情况称为色谱图。 ▪ 将样品加到柱上的操作称为上样或加样。
A+B+C
信 号
ACB C B A
C
B
C
A
B
C
A
B
C
图11-1 色谱洗脱过程与色谱图
t，min
（一）固定相 ▪ 可以是固体物质（吸附剂，凝胶，离子交换剂），也可以
（三）分配系数，分配比和选择因子
▪ 1、分配系数：在一定条件下，某种组分在固定相和流 动相中含量（浓度）的比值。它是色谱中分离纯化物质 的主要依据。langmuir
▪ 无论色谱分离的机理如何，当溶质浓度较低时，固定相 浓度和流动相浓度成线性的平衡关系。
色谱分离的技术
是所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。 若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103～105块塔板。 通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分 子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳 定的化合物，都可用色谱法分离。 色谱分离有很强的选择性, 可通过多种途径 选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
色谱分离技术的研究与应用
色谱分离技术的研究与应用第一章：绪论色谱分离技术是一种重要的分析和检测方法，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
其原理是利用样品中的化学物质在移动相和固定相之间的相互作用力的不同，使其在一定条件下在固定相上被分离。
本文将详细介绍色谱分离技术的研究和应用，并着重讨论其在医药领域的应用现状和未来发展方向。
第二章：色谱分离技术概述色谱分离技术包括气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱、离子色谱等多种分离方法。
其中，气相色谱主要应用于气态和揮发性样品的分离和分析，液相色谱适用于液态或溶解性样品的分离和分析，超临界流体色谱适用于高分子、生物、环境和天然产物等的分离与分析，离子色谱适用于阴、阳离子分离和有机物离子的分离和检测。
这些不同类型的色谱在分离物质的特性、原理和分析特点上各有不同。
第三章：色谱分离技术在医药领域的应用色谱分离技术在医药领域中得到了广泛的应用。
其中，液相色谱在药物分析、研究和质量控制方面应用最广泛。
利用液相色谱技术，可对药物的含量、杂质及某些药代动力学参数进行分析。
同时，液相色谱技术还可用于对传统药用资源中含有的多种化合物的化学成分进行深入分析和研究。
液相色谱技术在植物药物中的应用已成为当前植物药学研究的主要方法之一。
第四章：色谱分离技术在生物领域的应用色谱分离技术在生物领域中的应用越来越广泛，包括对多肽、多糖、蛋白质和核酸的分离和分析。
其中，高效液相色谱在生物大分子的纯化和鉴定中有着非常显著的优势。
同时，气相色谱-质谱联用技术在精确鉴定各种不同的小分子有机物和生物大分子结构中的小分子有机物残留方面也有着非常重要的应用。
第五章：色谱分离技术在环境领域的应用色谱分离技术在环境领域中也有非常广泛的应用。
其中，超临界流体色谱技术在环境样品的功效评价中已经被应用。
同时，离子色谱技术在环境中对含有异硫氰酸盐、硝酸盐、氯化物等阴离子物质样品的分析和检测有着非常显著的优势。
第六章：未来发展趋势随着对样品中化合物性质分析的需求越来越高，色谱分离技术也在不断创新和发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3、影响保留值的因素
• 离子对试剂 若组分离子和平衡离子只溶于水相，生成的 离子对只溶于有机相，则离子对生成反应的平衡 常数(又称提取常数)，可表示为：
对于某一特定的离子对分配体系，E为常数， 但它随着流动相的PH值、离子强度、流动相中有 机溶剂浓度和种类、温度的改变而变化。
• 离子对试剂 组分离子在两相问的分配系数可表示为：
•系统选择 使用一种有机溶剂(甲醇)； 流动相的其它三种成分为 pH=2.5(B)和pH=7.5(c)的缓 冲液以及另一种pH=5.5、其 中含有最大浓度(例如： 200mM)的离子对试剂的缓 冲液(D)。以组合不一的缓 冲液(B—D)进行七次实验， 并变化甲醇(A)量以保持每次 实验的k’值范围大致恒定。
• 梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。 可提高分离度、缩短分离时间、降低最小 检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复 杂混合物、特别是保留值相差较大的混合 物的分离是极为重要的手段。因为这些样 品的k’范围宽，不能用等度方法简单地处置。
• • • • •
优化梯度条件： 起始B% 终止B% 梯度时间tG 溶剂B的种类
三、如何提高柱效
• • • • 基本概念：理论塔板数n，理论塔板高度H 板高(H)越小，柱效(n)越高，峰宽(W)越窄 影响柱效的因素——速率理论 H=A+B/u+C*u
1、涡流扩散项(A)
• 当组分随流动相向往出口 迁移时，流动相由于受到 固定相颗粒的阻碍不断改 变流动方向，使组分分子 在前进中形成紊乱的类似 “涡流”的流动，导致谱 带展宽，故称涡流扩散。 • 采用小颗粒固定相，填充 均匀可提高柱效
可见，分配系数与提取常数和平衡离子的浓度 成正比。
• 组分离子的保留值受离子对的疏水性和平 衡离子的浓度所控制。离子对疏水性越强， 在非极性固定相上的溶解度越大，则保留 值越大。平衡离子浓度增加，有利于离子 对的形成，保留值也随之增加。但是，当 所有组分离子都以离子对形式存在时，保 留值为一常数。
五、确定最佳溶剂强度
• 另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实 验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范 围的大概溶剂成分。
六、优化流动相的选择性
• 三角形优化法(反相HPLC)
• 正相色谱
七、离子对色谱法
• 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分 子的一种色谱技术 • 关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明 确，但己提出三种机理：离子对形成机理， 离子交换机理，离子相互作用机理。在以 下讨论中，采用离子对形成机理。
4、改变选择性
• 改变溶剂种类 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相 色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别 的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改 进。
• 改变pH
组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都 与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变 体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分 有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离 解。要符合这一要求，只有使提供平衡离子的化合物在 一个很宽的pH范围内保持完全离解，因此，只有强酸 盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐)和强碱盐(季铵盐)才满足此 要求。
• 各种溶剂的极性——ε0、P’
• 混合溶剂的极性
2、改变选择性(α)
• 根据分子间作用力将溶剂分组 • 不容组的溶剂选择性不同 • 根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择 性
五、确定最佳溶剂强度
• 一种方法是首先试用一种可能过强的流动 相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以 增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围 时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已 接近最佳了。(观察待分离组分的分离度)
1、基本原理
• 有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键 合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电 荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电 引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称 它为平衡离子或成对离子。离子对的生成可由 下式表示：
• A-水相B+水相A-B+有机相分别表示组分离子A-、平衡 离子B+、离子对A-B+有机相在水相和有机相中。
H1 2d p
填充不规 则因子 固定相颗粒 直径
2、纵向扩散(B)
• 纵向分子扩散指沿X轴 方向的扩散，它是由 浓度梯度造成的。 • H2=k*Dm • Dm—组分分子在流动 相中的扩散系数 • 与流动相流速成反比
3、传质阻力项(C)
• 组分分子在两相之分 配时受到的阻力 • 流动相中的传质阻力 Cm=K*dp2/Dm
2、容量因子(k’)
• 容量因子(k’)增加，Rs增加。
• K’合适的范围：1~20 • 使k’改变的方法有；改变柱温；改变流动相性质 及组成(在液体色谱中)；改变相比。
3、选择性因子(α)
• α越大，柱选搀性越好，越能获得良分离
• 三个参数中，α的增加对分离度的提高最有效 • 改变方法：改变固定相、改变流动相、改变柱温、 改变样品结构——衍生化
• ②按化学官能团选择 • 当所选固定液分子具有与组分分子相同的官能团时，相互 作用力最强，选择性高。 • 如：分析酯类化合物，用酯或聚酯类固定液，分析醇类化 合物，用聚乙二醇等醇类固定液 • ③按主要差别选择 • 若组分主要差别是沸点，选非极性固定液 • 若组分主要差别是极性，选极性固定液 例：分离苯（80.1℃）和环己烷（80.7℃）沸点相差0.6℃ 则用非极性固定液（填充柱）分不开，用中等极性固定液， 则tR, 苯 =1.5 tR, 环己烷，用强极性固定液，则tR, 苯 =3.9 tR, 环己烷
• • • •
提高重现性： 色谱柱的平衡时间 溶剂 不同的设备
九、气相色谱相关技术
• 毛细管柱是将固定相涂在 管内壁的开口管，其中没 有填充物，毛细管柱的内 径从0.1 到0.5 毫米，典型 的柱长是30 米。 柱效高(A=0) 分析速度快 样品用量少 柱容量小
•
• 分流进样及尾吹技术 分流进样——毛细管柱有较小的样品容量，进样量必 须非常少，通常远少于1微升以防止色谱柱超载，如此小 的样品量操作起来是很困难的，分流模式提供了一种方法 来解决此问题，采用通常的进样量气化，然后只把其中一 部分引入到色谱柱内进行分析，其余大部分经分流出口放 空。 不分流进样——此模式特别适用于低浓度的样品，它将 样品捕集在柱头，同时将残留在进样口的溶剂气体放空。 尾吹——降低检测器的柱外效应 • 调节柱流量及分流比
二、影响分离度的因素
• 受动力学因素和热力学因素两方面的影响 • 基本分离方程
n 1 k' Rs ( )( ) 4 k '1
效率因子 选择性因子 容量因子
1、效率因子(n)
• 当固定相确定以后，要使一对组分的分离 达到某一分离度，柱必须具有最低限度的 理论塔板数(最小柱长)。 • 增加柱长可以提高分离度。 • 减小柱的H可以提高分离度，比增加柱长更 可取。
拖尾的原因
6、保护色谱柱
四、改变组分k’和α
• 液相色谱：改变流动相
正相色谱——吸附色谱(薄层色谱) 反相色谱——键合相色谱、反相离子对色谱(HPLC)
• 气相色谱：
毛细管色谱——柱温、 固定液
1、调节组分k’值
• 液相色谱——通过改变流动相极性调节组 分k’值。 • 溶剂极性与洗脱能力：
正相色谱——极性强洗脱能力强，组分k’减小 反相色谱——极性弱洗脱能力强，组分k’减小
• 柱温的选择
①影响因素：K，k’，Dm，Ds ②降低柱温优点 K↑，增加固定相的选择性 Dm↓，降低了组分在流动相中的纵向扩散，减少固定 液的流失，延长柱寿命，降低检测器本底 ③降低T的缺点 T↓，则Ds↓，Cs↑（传质阻抗）峰展宽 tR↑，分析时间↑
④综上，在使难分离物质对达到需求的分离度条件下， 尽可能采用低柱温 ⑤对于宽沸程的样品——程序升温(单阶程序升温多阶程 序升温) • 在分析过程中柱温随时间而变化，通常是升高柱温。 • 它的优点是 减少分析时间， 整个分离过程中峰形一致,检 测和测定更容易。 • 缺点：样品组分将经历比恒温分离更高的温度这可能会导 致某些敏感组分降解，在两次进样之间柱温箱必须冷却到 初始温度这样就抵消了部分所节省的分析时间。 • 初始温度、初始时间、升温速率、终止温度、终止时间
• 能用离子对色谱法分离的样品种类很多。 它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离 子、以及带有可离解的多宫能团化合物的 分离。 • 可用于生理体液的分析，如甾族化合物以 及体液中药物的分析。
2、反相离子对色谱法
• 固定相和流动相
在反相离子对色谱中，采用类似于反相键合相 色谱中所使用的固定相。 流动相为加有平衡离子和有机溶剂(如甲醇或乙 腈)的缓冲水溶液。平衡离子为四丁铵、烷基磺酸盐 等。
• 溶剂强度 通过改变混合流动相中的溶剂的相对比 例，可以改变溶剂强度。流动相中水的比 例减少，有机溶剂(如甲醇或乙腈)增加，溶 剂强度增加，k’值减少。
•Hale Waihona Puke pH值的影响以酸为例：在中等pH值内，组分具有最大的k’值。在此范围内，组分完全 离解，形成的离子对最多。当pH值降低阴离子开始形成酸分子，因此，进入 固定相的离子对减少，组分k’值减小。当流动相pH值较高时，OH-离子很多， 它们会与组分离子争夺平衡离子，以形成离子对，使组分离子形成的离子对 减少，组分的k’值下降。
色谱技术
——如何选择最佳分离条件
一、色谱的任务
• 色谱的首要任务是分离 • 关键在于建立色谱分析方法——优选最佳 色谱分离条件 • 为此要了解影响分离度的因素 • 掌握建立色谱分析方法——优化色谱分离 条件的一般步骤
二、衡量分离的指标——分离度
• 分离度：Rs=1.5 —基线分离—完全分离
t R 2 t R1 Rs 1 1 2 (W2 W )
• 液相色谱中减小流动 小粘度可以增大Dm