MTT实验步骤
MTT实验操作步骤
实验操作规程MTT实验操作步骤（一）MTT溶液的配置：市面上MTT的规格一般为100mg、250mg和1g的包装。
通常MTT配成的终浓度为5mg/ml，采用PBS或生理盐水做溶剂。
对于100mg的小包装，MTT放置在小管中，直接向管中加入0.5-1.0ml PBS，反复吹打若干次后将其转移至50ml离心管中。
重复2-3次上述操作，直至小管中的没有MTT残留，之后向50ml离心管中加入PBS直至离心管内的终体积为20ml。
将MTT溶液完全混匀后，用水相的0.22μm滤膜过滤，分装避光保存于-20℃。
分装的体积根据实验需求进行操作，如以每孔需要加入10μl计算，一般96孔板约需要1ml，因此分装时可每管分装1ml，如此可避免MTT溶液的反复冻融。
（二）化合物配制及稀释：一般化合物使用DMSO溶解配制成浓度为10mM的母液储存于-20℃。
稀释时从-20℃取出所需化合物常温融化，用1640（DMEM）基础培养基稀释化合物浓度至200μM(例如，取4μL浓度为10mM的母液溶于盛有196μL的1640基础培养基的1.5mL的EP管中，使其终浓度为200μM)。
铺板：96孔板的外周孔(绿色所示)由于存在边缘效应一般不进行实验操作，因此作为Blank 组，Blank组每孔加入120μL的1640（DMEM）基础培养基；剩余的中间60孔以实验具体要求分为control组(黄色所示)、阳性对照组(粉色所示)和实验组(蓝色所示)，control组中每孔加入50μL的1640（DMEM）基础培养基，阳性对照组每孔加入50μL的浓度为200μM的阳性药物，实验组每孔加入50μL的浓度为200μM的实验药物，每种化合物及阳性药物均做3个复孔，加完之后将96孔板放置在37℃含5% CO2的培养箱中进行预温。
（三）细胞处理：取对数生长期且已覆盖培养瓶底部面积80~90%的细胞，倒掉培养基，每瓶加入37℃预热的PBS清洗1次，倒掉PBS，加入1ml胰酶，放置37℃含5%CO2的培养箱中消化3min后取出培养瓶，向培养瓶中加入2ml预热的1640（DMEM）完全培养基终止消化反应，并用吸管反复吹打细胞混匀，将其转移至15ml离心管中使用1500rpm离心3min。
MTT方法
OD值大概在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系，但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳，若你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。
试验步骤：
一、弃去培养基，加入新鲜的培养基制成细胞悬液。
调整细胞密度约5*104/ml。
二、接种于96孔板，细胞数目不少500个每孔，每孔接种100μl。
设3-5个平行
样。
空白组（培养基，MTT、SDS-NHCL），实验对照组（细胞、培养基、相同浓度药物的溶解介质DMSO、MTT、SDS-NHCL），实验组（细胞、不同浓度的药物处理、MTT、SDS-NHCL）。
三、37℃，5%CO2培养箱培养。
待细胞长到贴壁生长长满。
四、实验组加入不同浓度的药物处理细胞。
五、给药处理细胞24h后，取出96孔板，每孔加入5mg/mlMTT溶液10μl，37℃
反应3h。
六、3h后，每孔加入100μl 10%SDS-NHCL溶液，37℃溶解过夜。
七、用酶标仪测各孔的吸光值，波长为570nm。
八、抑制率=（实验对照组吸光度的平均值—实验组吸光度的平均值）/实验对照
组吸光度的平均值*100%。
MTT比色实验步骤及注意事项
MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。
一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
mtt实验原理
mtt实验原理MTT实验原理是一种通过细胞代谢产物还原染色，进而测定细胞活性的方法。
MTT全称为3-(4,5)-二磷酸-5-(2,4-二硝基苯基)-2-四氮唑溴化物，是一种黄色的化学试剂，通过还原反应，可以生成紫色晶体，用于反映细胞的代谢活力。
MTT实验基本原理MTT实验的基本原理是将MTT溶液与脱氧核糖核酸（DNA）和细胞色素c等呈还原态的细胞代谢产物作用，产生紫色的晶体。
通过比色法测定反应产物的吸收值，反映出细胞的代谢活力。
MTT实验原理流程MTT实验的原理流程可以概括为以下几个步骤：1、细胞培养将目标细胞培养于带有适宜培养基的正常生长环境下，使其形成单层细胞。
2、添加MTT试剂将MTT试剂添加入培养基，经过一定时间的反应，并在多孔板中进行细胞培养，MTT会被细胞内的代谢产物还原为紫色晶体。
3、去除细胞体外产物过滤或洗涤的方法去除细胞外的代谢产物和没反应的MTT试剂。
4、添加适宜的溶解剂MTT试剂在细胞中被还原后，需要使用DMSO等适宜的试剂将细胞内MTT晶体溶解，使其在液相中变为可测反应产物。
5、检测反应产物的吸收值使用分光光度计等测量仪器检测溶解后的反应产物吸收值，根据吸收值反映细胞活性。
MTT实验应用范围MTT实验作为一种简单、快捷、可靠的细胞活性检测方法，已被广泛应用在细胞学、药理学、生物技术、毒理学等领域。
MTT实验可在分析化学、医学、生物学等学科中作为一种常用的实验方法。
1、药效评价MTT实验可用于评估药物对细胞的生长抑制和细胞毒性等药效指数，是一种高度敏感的细胞毒性检测方法。
2、细胞增殖力MTT实验可以评估细胞增殖率，了解细胞的生存状态，是细胞培养研究中常用的一种技术。
3、合成物毒性用MTT实验检测化合物对细胞内能量代谢的影响，可以评估不同化合物对细胞的毒性程度。
4、细胞抗氧化能力MTT实验还可用于检测细胞的抗氧化能力和自由基清除能力等。
总结MTT实验是一种常用的细胞代谢活力检测方法，相比其他方法具有操作简便、高度敏感、重复性好等优点。
MTT实验原理步骤注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT实验步骤
MTT实验步骤普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT 的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞：1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
MTT实验方法
MTT实验
1. 接种细胞，吸出旧培养基，用适量DPBS洗去残留培养基，加入适量胰酶消化，用新鲜培养基重悬细胞并计数（1*10^5个细胞/ml,视细胞大小及生长速度而定），每个孔做3-5个重复。
根据设定的时间梯度确定板的个数
2. 接种4h（0天）之后加入含10ulMTT的培养基100ul，37摄氏度培养1-4小时
3. 吸出培养基，加入100ulDMSO震荡溶解10分钟或37度孵育30min
4. 检测OD490或者570
5. 第二天或第三天（根据自己设定的时间梯度）重复步骤2-4
注意：
接种细胞及加入MTT时可沿着96孔板的侧壁加，尽量减少气泡产生
接种细胞比较多时应注意经常颠倒混匀或吹打混匀，减少人为造成的孔间及板间误差
吸出培养基时可以用小枪头吸干净减少误差
通常35mm的小皿加培养基2ml，DPBS 1ml，胰酶200ul，消化1min（可以减少胰酶用量，延长消化时间）
60mm的小皿加4ml培基，DPBS 2ml，胰酶400ul，消化1min左右
10cm大皿加10-8ml培基，DPBS 3-4ml，胰酶600ul，消化1min左右。
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MTT实验步骤
收藏人：lipy0226
2011-08-03 | 阅：5328 转：84 | 来源 | 分享
普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h 终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤
贴壁细胞：
1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午
加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞：
1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100
加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100ml 1640）
2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 mi
使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、
养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
注意事项：
(1) 选择适当得细胞接种浓度。
(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔
内残余培养液。
(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
其他试验步骤保持一致，
最后比色以空白调零。
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适
根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于
DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
6) 一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清
液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。