分析化学第七章吸光光度法
分析化学-吸光光度法的灵敏度与准确度
1吸光光度法的灵敏度与准确度灵敏度的表示方法1.摩尔吸光系数 (ε)A= ε b c ε=A/bc (L·mol -1·cm -1)ε 越大, 灵敏度越高:ε <104 为低灵敏度;104～105 为中等灵敏度;ε >105为高灵敏度.9.39.3.122. Sandell(桑德尔)灵敏度 (S )定义定义：：截面积为1cm 2的液层在一定波长或波段处的液层在一定波长或波段处，，测得吸光度为0.001时所含物质的量时所含物质的量。
用S 表示表示，，单位：µg ·cm -2A = ε bc =0.001 bc ＝0.001/ εS 小灵敏度高灵敏度高;; ε 相同的物质, M 小则灵敏度高.3210==(g/cm ) 10.00MMS µεε×变换单位:b cm c mol/L=bc M 106 µg/1000cm 23例1 邻二氮菲光度法测铁ρ(Fe)=1.0mg/L,b =2cm , A =0.38 计算ε 、S 和解：c (Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3/55.85 =1.8×10-5(mol·L -1)E 1%1cm 4-1-1-50.38==1.110L mol cm 2 1.810ε×⋅⋅××（）S =M /ε=55.85/1.1×104=0.0051 (µg /cm 2)321g/cm 2cm 0.001==0.0051g/cm 0.38S µµ××或4c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL = 1.0×10-4 g/100mL1%1cm=A Eb c⋅⋅-111%cm-431=0.38/2.010=1.910100mL g cm E −××⋅⋅（）1%1cm53=10=1.110/55.85 /M =9101.Eε××或5例2 比较用以下两种方法测Fe 的灵敏度.B. 用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁ε533＝2.2×104 L·mol -1·cm -1S = 55.85/(2.2×104)＝0.0025 (µg ·cm -2)B 方法比A 方法的灵敏度高.A. 用邻二氮菲光度法测定铁时用邻二氮菲光度法测定铁时，，ε508＝1.1×104 L·mol -1·cm -1S = 55.85/(1.1×104)＝0.0051 (µg ·cm -2)准确度—仪器测量误差10080604020T/%1∆c2∆c3T∆T∆T-透光率读数误差c∆c1c1∆c2c2∆c3c3><由于T 与浓度c 不是线性关系性关系，，故不同浓度时的仪器读数误差 T引起的测量误差 c/c不同。
吸光光度法参比溶液的选择原则
吸光光度法参比溶液的选择原则吸光光度法是一种常用的分析化学方法，通过测量溶液对特定波长的光的吸收程度来确定溶液中物质浓度的方法。
在进行吸光光度法测量时，参比溶液的选择非常重要，它直接影响到测量结果的准确性和可重复性。
下面将介绍吸光光度法参比溶液的选择原则。
1.具有稳定的吸光度：参比溶液应该具有稳定的吸光度，在测量时间范围内不发生明显变化。
这可以通过测量该溶液的吸光度随时间变化的曲线来确定。
2.不与待测物相互干扰：参比溶液的吸光度不能受到待测物的影响，否则会导致测量结果的偏差。
因此，在选择参比溶液时要确保它与待测物在所选波长的吸光度范围内没有重叠。
3.与待测物具有相似的化学性质：参比溶液应该与待测物具有相似的化学性质，以确保它们在溶液中的反应行为相似。
这样可以使参比溶液对溶液中可能存在的干扰物的响应与待测物的响应保持一致。
4.与溶剂相容：参比溶液应该与所选溶剂相容，不发生溶解度或稳定性问题。
这样可以确保在测量过程中不会发生结晶、沉淀或其他不可逆反应，从而影响测量结果的准确性和稳定性。
5.易于制备和稀释：参比溶液应该容易制备和稀释。
制备参比溶液的方法应简单、可靠，并且可以精确地控制其浓度。
此外，参比溶液的稀释过程应能够保持其吸光度的稳定性和准确性。
6.已有文献支持：在选择参比溶液时，可以参考已有的文献或相关方法来确定最佳的参比溶液。
这些文献通常提供了制备和使用参比溶液的详细步骤，以及其在特定条件下的吸光度范围和稳定性。
综上所述，参比溶液的选择对于吸光光度法的测量结果至关重要。
通过选择具有稳定吸光度、不受待测物干扰、具有相似化学性质、与溶剂相容、易于制备和稀释，并且有文献支持的参比溶液，可以确保吸光光度法的测量结果准确可靠。
在进行吸光光度法测量时，应对参比溶液的选择进行严格控制，并根据实际分析需要进行优化。
分析化学吸光光度法
3. 稀溶液
浓度增大，分子之间作用增强
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亚甲蓝阳离子 单体 max= 660 nm 二聚体 max= 610 nm
(nm)
亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱 a. 6.36×10-6 mol/L b. 1.27×10-4 mol/L c. 5.97×10-4 mol/L
二聚体的生成破坏 了A与c的线性关系
It
s
b dx
A=lg(I0/It)=k1b
比尔定律(1852)
A=lg(I0/It)=k2c
A=lg(I0/It)=kbc
吸光度
介质厚 度(m)
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T－透光率（透射比）
（Transmittance）
T=
It I0
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc
-kbc -A T = 10 = 10
7
光学光谱区
远紫外
（真空紫外）
近紫外 可见
近红外
中红外
远红外
10nm~200nm 200nm ~380nm
380nm 780 nm ~ 780nm ~ 2.5 m
2.5 m ~ 50 m
50 m ~300 m
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3. 溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm
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朗伯-比尔定律的分析应用
溶液浓度的测定
A＝ bc
0.8
A
工作曲线法
0.6 0.4 0.2 0
*
(校准曲线)
0
1
2
3
4
mg/ml
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6. 吸光度的加和性与吸光度的测量 A = A1 + A2 + … +An
(分析化学)第七章：吸光光度法
Analytical chemistry
ε 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液
的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
影响ε值大小的因素 (1)入射光波长 (2)与被测物质有关 (3)温度，酸度，介质，有色物结构， (4)ε不随 c或b值变化
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Analytical chemistry
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2、溶液本身的化学和物理因素引起的偏离 (1)溶液介质不均匀引起的 (2)溶液中的副反应发生而引起的
(3)反应条件影响显色反应
[例如] Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO4橙色 λ1max=350nm 黄色 λmax=375nm
当物质对光完全透光时，T=1，A=0 当物质对光全部吸收时，T=0，A=∞ 朗伯-比尔定律的数学表达式
A Kbc
单色光垂直照射含有吸
光物质的溶液时，溶液的 吸光度与吸光物质的浓度 及液层的厚度成正比。
I0 Ir Ia
It
Analytical chemistry
其中，A:吸光度，T:透射比，
K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度
三、物质对光的选择性吸收
物质为何吸收某种光？ 物质为何有不同的颜色？
物质由低能态向高能态跃迁
需要吸收能量。如果照射到物
质的光子的能量与分子的E匹 配时，就会吸收光子，发生能 级的跃迁。
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Analytical chemistry
E E1 E0 hv h
1、分子吸收光谱：
Analytical chemistry
吸光光度法
（1）吸收系数
第一、吸收系数a
当c的单位为g/L，b的单位为cm时，K用a表示 ，称为吸收系数，其单位为L/g·cm，这时朗伯-比 耳定律变为： A＝abc
第二、摩尔吸收系数κ
当式中浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位 为cm时，则用另一符号κ表示，称为摩尔吸收系数 ，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时 ，溶液的吸光度。其单位为L/mol·cm。这时朗伯比耳定律就变为: A＝κbc
4、检测系统(又叫光电转化器)
在光度计中，常用的是硒光电池。硒光电池和眼睛相 似，对于各种不同波长的光线，灵敏度是不同的。对于波 长为500-600nm的光线最灵敏。而对紫外线，红外线则 不能应用。
光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中。具 有灵敏度高、光敏范围广及不易疲劳等特点。
1、选择性要好
一种显色剂最好只与一种被测组分起 显色反应，这样干扰就少。或者干扰离 子容易被消除、或者显色剂与被测组分 和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰 相隔较远。
3、对比度要大
如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的 最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上 。
5、显色反应的条件要易于控制
但有时会发生偏离, 特别在浓度较大时, 偏离更大.
原因:1)非单色光、非0平行光 c 2)化学因素:离解、缔合、异构化等
1、物理因素
（1）单色光不纯所引起的偏离
严格地讲，朗伯-比耳定律只对一定波长的单色 光才成立。但在实际工作中，目前用各种方法得到 的入射光并非纯的单色光，而是具有一定波长范围 的单色光。那么，在这种情况下，吸光度与浓度并 不完全成直线关系，因而导致了对朗伯—比耳定律的 偏离。
分析化学 第七章 吸光光度分析法
用不同波长的单色光照射，测吸 光度— 吸收曲线与最大吸收波长 max；
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光吸收曲线
用不同波长的单色光照射某一物质测定吸 光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标， 绘制曲线，描述物质对不同波长光的吸收能 力。
图8-1吸收曲线
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吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不 同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收 波长λmax （2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线 形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们 的吸收曲线形状和λmax则不同。
(2)化学性因素
朗伯-比耳定律假定：所有的吸光质点之 间不发生相互作用，实验证明，这种假定只有 在稀溶液时才基本符合。
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当溶液浓度c >10-2mol·-1时，吸光质点间 L 可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光 的吸收。朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配 合物的形成等化学平衡时，使吸光质点的浓 度发生变化，影响吸光度。 (3)工作曲线不过原点 存在系统误差：吸 收池不完全一样；参比 溶液选择不当等。
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三、光吸收的基本定律
1.朗伯—比耳定律 • 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于
1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收
层厚度的关系。A∝b
• 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和
吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝ c • 二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表 达式为：
2.选择适当的显色反应条件 通过控制适宜的显色条件，消除干扰组分 的影响。 3.选择适宜的波长 避开干扰物的最大吸收，配制适当的参比 液，消除干扰组分的影响。
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4.提高显色反应的选择性
仪器分析 第七章 原子吸收光谱法
第七章原子吸收光谱法1.原子吸收光谱的历史2.原子吸收光谱的特点3.原子吸收光谱与紫外可见吸收光谱的区别4.原子吸收光谱分析过程第一节概述1. 原子吸收光谱的历史◆1802年，沃拉斯顿(Wollaston)在研究太阳连续光谱时，首次发现太阳连续光谱中出现暗线。
◆1817年，夫琅和费(Fraunhofer)研究太阳连续光谱时再次发现这些暗线，但无法解释暗线产生的原因。
2/1363/1361825年，法国著名哲学家孔德在哲学讲义中说“恒星的化学组成是人类绝对不能得到的知识”◆1859年，本生、基尔霍夫研究碱金属和碱土金属火焰光谱时，发现钠蒸气发出的光通过温度较低的钠蒸气时，会引起钠光的吸收，并且钠在光谱中位置相同。
发射线与暗线D◆太阳光谱暗线：太阳外围大气圈中钠原子对太阳光谱中钠辐射特征波长光进行吸收的结果。
4/1365/136太阳中含有94种稳定和放射性元素：氢(71％)、氮(27％)、氧、碳、氖、硅、铁等。
◆1955年，澳大利亚物理学家Walsh（沃尔什）发表了著名论文《原子吸收光谱法在分析化学中的应用》，奠定了原子吸收光谱法的基础。
◆1960年以后，原子吸收光谱法得到迅速发展，成为微量、痕量金属元素的可靠分析方法。
6/1362. 原子吸收光谱法的特点✓检出限低：10-10～10-14g。
✓准确度高：1%～5%。
✓选择性好：一般情况下共存元素无干扰。
✓应用范围广：可测定70多种元素。
✗缺点：难熔元素、非金属元素测定困难，不能实现多元素同时分析。
7/1363. 原子吸收与紫外可见吸收的区别✓相同点：利用物质对辐射的吸收进行分析。
✗不同点：◆吸收机理不同：紫外可见为溶液中分子或离子宽带吸收，带宽为几纳米至几十纳米；原子吸收为气态基态原子的窄带吸收，带宽仅为10-3nm。
◆光源不同。
◆试样处理、实验方法及对仪器的要求不同。
8/1364. 原子吸收光谱分析过程◆确定待测元素。
◆选择该元素相应锐线光源，发射出特征谱线。
大学分析化学实验：实验七分光光度法测铁
按MODE键
使其指向A
4、测值：将被测样品1号（推）入光路中，读取 A值。
例如：该数值 0.214
5、从样品室中取出比色皿，倒去其中溶液，用蒸馏 水冲洗干净 ，继续测量其它5个样品。
仪器停止工作时，必须切断电源，应 按开关机顺序关闭主机和稳流稳压电 源开关；
比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或 有机溶剂冲洗干净，把水渍擦净；
（二）7200型分光光度计使用：
功能选择键
样品室
拉杆
波长旋转按钮
（一）仪器基本操作
1、打开电源、预热20分钟 2、选择波长：用波长选择旋钮设置波长550nm
校正调0
校正调100：将参比溶液拉（推）入光路中，按 “100%/INC”键，此时显示屏显示由“BLA”到 “100.0%T”为止。
按“100%/INC”键
校正调100
确认：反复拉（推）动样品室拉杆，查看黑体或参 比溶液在光路中时，显示屏是否仍然显示 “000.0”T或“100.0%T”。
校正完成后，将参比溶液拉（推）入光路中，按 “MODE”键将测试模式转换为吸光度（A），此时显示 屏由“100.0%T”变为“0.000A”，可以进行样品吸光值 的测定。
M + nR ⇌ MRn 配当离配子离浓子度不越稳大定，或有 溶干液扰的，颜会色出越现深比，尔朗伯的偏离。 吸光度值也就越大
2.标准曲线测定原理
工作曲线图
吸 光 度
浓度（c）
(三)、实验仪器与试剂
仪器 7200分光光度计 50mL容量瓶 2mL吸量管 1CM比色皿一套
试剂
0.1g.L-1铁标准溶液储备液 1.5g.L-1邻二氮菲水溶液 10%盐酸羟胺水溶液 1mol.L-1醋酸钠溶液 0. 1mol.L-1NaOH溶液 1mol.L-1醋酸
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0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm
x 射射 线线
紫红 外外 光光
微
无
波
线
电
波
可见光
(1)单色光：单一波长下的光 (2)复合光：不同波长的光的混合光 (3)互补光：按一定比例混合为白光的两种光
白光
红(长波)
蓝(短波)
紫外 | 紫 | 蓝 | 青 | 绿 | 黄 | 橙 | 红 | 红外 400 450 480 500 560 600 650 750 nm
(3)同一物质分子运动的形式相同，结构相同，在不 同浓度下，吸收曲线的形状相同，且λmax位置不变
(4)不同物质的吸收曲线形状不同，决定了物质的结 构分析的依据
Cr2O72- MnO4-
(5)若选择在λmax处测量A，则灵敏度高 2、物质的颜色
溶液呈现的颜色与吸收光颜色及波段的关系
物质的颜色
吸收光
二、显色剂
1、 无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾
2、 有机显色剂： （1）偶氮类：偶氮胂III
AsO 3 2H OH OH H2 3O As
NN
NN
HO3S
SO3H
（2）三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料 铬天菁S
COOH HO
CH3
C
Cl
CO：新亚铜灵
颜色
波长范围( l ,nm)
黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
溶液呈现的颜色是其吸收光的互补光的颜色。
7.2: 光吸收定律
分析化学第七章吸光 光度法
7.1: 概述
一、吸光光度法 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。 许多物质呈现颜色，而且颜色深浅与浓度有关
二、方法特点： 1、灵敏度高，能测<1.0%----ppb级，微量级痕量
组分； 2、准确度较高； 3、简便，快速，应用广泛．
二、电磁波谱
10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm
由于分子结构不同，分子运动形式不同，运动所 需能量不同，而吸收 不同能量的光 ，分子的能级是 量子化的，因而吸收的光子的能量也是不连续的。
(1)同一物质对不同波长的光的吸收强度不同，如 KMnO4对400nm吸收少，对525nm吸收最大，称λmax
(2)同一物质浓度一定时，在某波长下吸收强度一定 ，浓度不同吸收强度不同，c愈大，A愈大，c3>c2>c1 是光谱定量的依据
氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在
650nm测定光吸收，A＝0.43，求ε(Nb原子量92.91)。
c10639012.9010500mol/L
A3.3140 Lmo 1clm 1
bc
2、桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所
absorptivity) A= K·b·c
(1)当 c= g/L时：b=cm； K=a = L·g-1·cm-1 (2)当 c=mol/L时：b=cm； K=ε=L·mol-1·cm-1
ε 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液 的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
影响ε值大小的因素 (1)入射光波长 (2)与被测物质有关 (3)温度，酸度，介质，有色物结构， (4)ε不随 c或b值变化
AKbc
I0
It
单色光垂直照射含有吸 Ir
Ia
光物质的溶液时，溶液的
吸光度与吸光物质的浓度
及液层的厚度成正比。
其中，A:吸光度，T:透射比， K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度
注意： 平行单色光 均相介质 无发射、散射或光化学反应
二、吸光系数、摩尔吸光系数 1、吸光系数a 和摩尔吸光系数ε( Molar
2、单色器(Monochromator)：将连续光谱分解为 按波长排列的单色光
3、比色皿（吸收池）：材质相同的玻璃，石英制 成0.5，1.0，2.0，3.0cm
4、检测器(Detector)：接受比色皿透过的光强，转 换为电信号，并放大显示，读取 T，A，c
光电管：产生光电流，在电阻两端产生电压降
7.4 显色反应及影响因素
能检测到的吸光物质的最低含量。 单位：μg/cm2
SM
三、吸光度A的加和性
若溶液中含有不止一种吸光物质，则总吸光度 等于各个组分吸光度之和：
A=A1+A2+......+An = ε1bc1+ ε 2bc2 + ......+εnbcn
7.3 分光光度计
光源
0.575
单色器
检测器 显示
吸收池
1、光源(Source)：75W钨灯，发射出360--800nm 波长的连续光谱
一、 显色反应
没有颜色的或颜色较浅的化合物，需要通过适当的 反应定量生成有色化合物再测定－ 显色反应。
MRMR
被测物 显色剂 有色化合物 对显色反应的要求： 1、选择性好 2、灵敏度高 (ε>104)
3、 产物的化学组成稳定 4、 化学性质稳定 5、 显色剂和产物有明显的颜色差别 (λ>60nm)
一、朗伯-----比耳定律
当一束强度为I0的平行单色光入射到厚度为b的溶 液上，一部分光被吸收（强度为Ia），剩余的光透过（ 强度为It）
I0 Ia It
透光率 吸光度
T It 100% I0
AlgT -lgIt I0
当物质对光完全透光时，T=1，A=0 当物质对光全部吸收时，T=0，A=∞
朗伯-比尔定律的数学表达式
蓝绿
绿 黄绿 黄
绿蓝
橙
蓝 紫 紫红
红
三、物质对光的选择性吸收 物质为何吸收某种光？ 物质为何有不同的颜色？
物质由低能态向高能态跃迁 需要吸收能量。如果照射到物 质的光子的能量与分子的E匹 配时，就会吸收光子，发生能 级的跃迁。
EE1E0hvhc
1、分子吸收光谱：
将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的 有色溶液，测量每一波长下，有色溶液对光吸收的 强度(A)，作 A--λ曲线图 ，得到吸收光谱。
N CH3
N CH3
（4）肟类：丁二肟
CH3 C C CH3
N HO
N
OH
三、 多元络合物
混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 离子缔合物 AuCl4--罗丹明B 金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB