植物组织培养的基本方法PPT讲稿
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《植物组织培养》课件PPT第1章植物组织培养基本知识
②生长周期短，繁殖率高
由于人为控制培养条件，因此生长较快，一般20—30d为一个周期。植物 材料按几何级数繁殖生产，总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致 的优质种苗或脱病毒种苗。
③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿 度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利 于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、 田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂 劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
愈伤组织（callus）:在人工培养基上由外植体上形成的一
团无序生长状态的薄壁细胞。
愈伤组织
二、植物组织培养的类型
• 按培养方法分为 固体培养 液体培养 看护培养 微室培养 包埋培养
二、植物组织培养的类型
3.按培养过程分为：
• 初代培养（Primary culture）(无菌培养物)
将从植物体上分离下来的第一次培养。
4.4 组织及细胞培养生产有用物质
Arregnin和bonner在1950年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获 取橡胶的尝试。
近50年来飞速的发展。从400多种植物培养细胞中分离到600多种 次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于其原植物，20种 以上干重超过1％。 在日本，人参细胞培养已达130600L发酵罐；德国用1000L发酵罐 培养毛地黄细胞；在我国，人参细胞培养技术也已实现产业化。 利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行 了出色的研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的 中间化合物毛地黄毒素和一甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎 100％的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。
植物组织培养ppt课件
问题
3
植物自然条件下的繁殖方法有哪些？ 种子繁殖 无性繁殖
4
各种形态的种子
5
种 子 和 果 实 的 产 生
无性繁殖6
植物组织培养的基本原理
7
1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植 物组培的理论基础。
1958年，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部 的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株 能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞 全能的预言。
结论：生长素及细胞分裂素的比例可影响细胞的脱 分化及再分化。
pH ——一般控制5.8 无菌 ——操作台、培养基、实验仪器等
2 植物组织培养过程
17
根
离体的植物器官、 组织或细胞
脱分化
（外植体）
愈 伤 组 织
芽
再分化 胚 状
植 物 体
体
植物组织培养过程示意图
18Βιβλιοθήκη ①叶片接种到培养基上②产生愈伤组织
③愈伤组织增殖
④愈伤组织开始分化
⑤愈伤组织分化出芽
⑥培养基中的试管苗
能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。
二、植物组织培养技术
14
1 培养条件
MS培养基配方 单位（mg/L）
15
KNO3
1900
NH4NO3
1650
KH2PO4
170
MgSO4.7H2O
370
CaCl2.2H2O
440
Na2.EDTA
37.3
FeSO4.7H2O
27.8
盐酸硫胺素（VB1） 0.1
20世纪80年代，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适 当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同 类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。
第二章植物组织培养的一般技术ppt课件
称量大量元素的化合物用感量为0.01克的扭力天平 即可。
微量元素母液的配制
微量元素母液浓度宜为原培养基配方中用量的100 倍。
一般将微量元素分别称量溶解，贮存在一个瓶个， 但也有将KI分别配制，单独贮存在棕色瓶中。
称量微量元素化合物宜用感量为0.0001g的电子分 析天平。
铁盐母液配制
无菌操作
大量元素母液的配制
大量元素母液浓度一般为原培养基浓度的10、20或 50倍，有时也可用l00倍，倍数不宜过高，也不宜过 低。
有时将CaCl2·2H2O单独配制保存，以免长期贮存发 生沉淀。
将全部大量元素配在一起时，为防止在混合时发生沉 淀，须在各药品充分溶解后，按表中顺序混合，氯化 钙最后加入，以免与硫酸镁形成沉淀。
玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌
用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
布制品采用高压灭菌
其他
植物材料的表面灭菌
培养基的成分及作用
在完善的培养基配方中至少应包括下述几个部分：
大量元素 微量元素 铁盐 有机成分 琼脂 糖 植物激素 PH 其它成分
多年的研究结果： Cu有促进离体根生长的作用； Mo是合成活跃硝酸还原酶所必不可少的元素，也
肌醇：本身没有促进生长的作用，但有助于活性物质的发挥， 并参与糖代谢，能使培养组织快速生长，对胚状体和芽的形 成有良好的影响
氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 水解酪蛋白、水解乳蛋白
有机添加物：椰乳、香蕉等
琼脂
一种从海藻中提取出来的凝固剂，一般使用浓度为 0.6%—1%。以前使用琼脂条，现在使用琼脂粉， 以色白、洁净的为好。
它们作用强弱顺序：2，4－D >NAA>IBA>IAA
微量元素母液的配制
微量元素母液浓度宜为原培养基配方中用量的100 倍。
一般将微量元素分别称量溶解，贮存在一个瓶个， 但也有将KI分别配制，单独贮存在棕色瓶中。
称量微量元素化合物宜用感量为0.0001g的电子分 析天平。
铁盐母液配制
无菌操作
大量元素母液的配制
大量元素母液浓度一般为原培养基浓度的10、20或 50倍，有时也可用l00倍，倍数不宜过高，也不宜过 低。
有时将CaCl2·2H2O单独配制保存，以免长期贮存发 生沉淀。
将全部大量元素配在一起时，为防止在混合时发生沉 淀，须在各药品充分溶解后，按表中顺序混合，氯化 钙最后加入，以免与硫酸镁形成沉淀。
玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌
用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
布制品采用高压灭菌
其他
植物材料的表面灭菌
培养基的成分及作用
在完善的培养基配方中至少应包括下述几个部分：
大量元素 微量元素 铁盐 有机成分 琼脂 糖 植物激素 PH 其它成分
多年的研究结果： Cu有促进离体根生长的作用； Mo是合成活跃硝酸还原酶所必不可少的元素，也
肌醇：本身没有促进生长的作用，但有助于活性物质的发挥， 并参与糖代谢，能使培养组织快速生长，对胚状体和芽的形 成有良好的影响
氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 水解酪蛋白、水解乳蛋白
有机添加物：椰乳、香蕉等
琼脂
一种从海藻中提取出来的凝固剂，一般使用浓度为 0.6%—1%。以前使用琼脂条，现在使用琼脂粉， 以色白、洁净的为好。
它们作用强弱顺序：2，4－D >NAA>IBA>IAA
《植物组织培养技术》课件
04 植物组织培养技术的应用实例
快速繁殖技术
快速繁殖技术是指利用植物组 织培养技术，快速、大量繁殖
植物种苗的一种方法。
该技术广泛应用于花卉、果树 、林木等植物的快速繁殖，能 够大大缩短繁殖周期，提高繁
殖系数。
快速繁殖技术还可以通过控制 培养条件，实现植物的定向繁 殖，如矮化、无病毒等。
快速繁殖技术具有高效、环保 、可重复利用等优点，是现代 农业和林业生产的重要手段之 一。
濒危植物保护与复壮是保护生 物多样性和维护生态平衡的重 要手段之一，具有深远的社会 意义和生态意义。
05 植物组织培养技术的挑战与前景
技术瓶颈与解决方案
技术瓶颈
目前植物组织培养技术面临的主要瓶颈包括培养基的优化、外植体的选择与处 理、污染控制以及基因转化效率等。
解决方案
针对这些问题，研究者们正在探索新型的培养基成分、优化外植体的选择标准 、开发新型的消毒方法以及改进基因转化技术，以期提高植物组织培养的效率 和成功率。
指任何一个植物细胞都包含该物种的 全套遗传信息，具有发育成完整个体 的潜在能力。
植物细胞全能性证明
植物细胞全能性的应用
植物组织培养技术利用植物细胞的全 能性，通过离体培养获得完整的植株 ，广泛应用于植物繁殖、品种改良、 基因工程等领域。
许多植物细胞如胡萝卜、烟草、草莓 等在适宜条件下能够发育成完整的植 株，证明了植物细胞的全能性。
技术发展趋势与展望
发展趋势
随着生物技术的不断发展，植物组织培 养技术也在不断进步和完善。未来，该 技术将更加注重与基因编辑、合成生物 学等新兴技术的结合，以实现更为精准 和高效的植物育种和种质资源保护。
VS
展望
未来，植物组织培养技术有望在农业、园 艺、林业等领域发挥更大的作用，为解决 全球粮食安全、生态恢复等问题提供有力 支持。
植物组织培养的基本原理PPT课件
3
细胞全能性（红罗卜）
4
1.2 植物细胞的分化与脱分化
1.分化〔differentiation〕： 细 胞在分裂过程中发生结构和功能 上的改变，从而在个体发育中形 成各类组织和器官完成整个生活 周期。
5
高等植物细胞分化示意图
幼
多
形
完
年 细胞分裂 细 细胞分化 态
整
细
胞
建
植
胞
团
成
株
6
1.2 植物细胞的分化与脱分化
33
2019/12/30
34
愈伤组织的类型：
不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和
物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈
淡黄色或白色，有的愈伤组织呈绿色或红色。
ห้องสมุดไป่ตู้
一般来说，来源于相同组织的愈伤组织含有
的色素大致相同， 但经过反复继代培养后会失去
色素。
35
植物愈伤组织类型举例：
根尖愈伤组织 （无色透明）
45
不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响
愈伤分化 46
茎尖愈伤组织 （淡绿色）36
锁阳愈伤组织（红色） 香茶菜愈伤组织
当归茎段愈伤组织（绿色）
37
影响植物愈伤组织形成的因素：
1、 同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同。例如： 君子兰 用MS+2mg/L 6-BA +2mg/L NAA +1mg/L 2,4-D 固体培养基培养，茎尖、茎切块和叶 片形成愈伤组织的诱导率分别为85%、13%和72%； 若用MS+5mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA +1mg/L 2,4-D 固体培养基培养,三种外植体形成愈伤组织的诱 导率分别为82% 、9%和70%。这说明培养基中植物 生长物质组成的比例不同，直接影响着愈伤组织的形成。
细胞全能性（红罗卜）
4
1.2 植物细胞的分化与脱分化
1.分化〔differentiation〕： 细 胞在分裂过程中发生结构和功能 上的改变，从而在个体发育中形 成各类组织和器官完成整个生活 周期。
5
高等植物细胞分化示意图
幼
多
形
完
年 细胞分裂 细 细胞分化 态
整
细
胞
建
植
胞
团
成
株
6
1.2 植物细胞的分化与脱分化
33
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愈伤组织的类型：
不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和
物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈
淡黄色或白色，有的愈伤组织呈绿色或红色。
ห้องสมุดไป่ตู้
一般来说，来源于相同组织的愈伤组织含有
的色素大致相同， 但经过反复继代培养后会失去
色素。
35
植物愈伤组织类型举例：
根尖愈伤组织 （无色透明）
45
不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响
愈伤分化 46
茎尖愈伤组织 （淡绿色）36
锁阳愈伤组织（红色） 香茶菜愈伤组织
当归茎段愈伤组织（绿色）
37
影响植物愈伤组织形成的因素：
1、 同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同。例如： 君子兰 用MS+2mg/L 6-BA +2mg/L NAA +1mg/L 2,4-D 固体培养基培养，茎尖、茎切块和叶 片形成愈伤组织的诱导率分别为85%、13%和72%； 若用MS+5mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA +1mg/L 2,4-D 固体培养基培养,三种外植体形成愈伤组织的诱 导率分别为82% 、9%和70%。这说明培养基中植物 生长物质组成的比例不同，直接影响着愈伤组织的形成。
植物组织培养【优质PPT】
2021/5/27
26
2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）
1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取 液可促进离体胚的生长。
1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植 物生长发育的控制起重要作用。
1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层 诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细 胞培养也得到了类似的结果。
（3）液体培养(Liquid Culture)：震荡、旋转或静置培 养。
2021/5/27
16
固体培养： 液体培养
2021/5/27
17
三、植物组织培养技术的理论基础
植物细胞的全能性(Plant cellular totipotency）
从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该 植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件 下，具有发育成完整植株的潜在能力。
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3、植物组织培养技术的发展（1960年以后）
1960年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖；
1962年，Murashige和Skoog开发出最著名的Murashige和Skoog培养基 （MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。
1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例 单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。
细胞团培养
茎尖分生组织培养 原生质体培养
2021/5/27
4
矮牵牛茎尖离体培养培养
2021/5/27
5
2021/5/27
大蒜根尖培养及植株
植物组织培养技术PPT讲座
4、用70－75％旳酒精拭擦台面并消毒双手。试 验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器 械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：全部操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金 属器械不能过分灼烧，以防退火。移液管不能灼烧， 培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太 长。
5、取流水冲洗（至少30min）过旳外植体，用一 定旳消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入 无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌旳接 种器械进行分离、切割或其他处理。
（5）火焰灼烧灭菌
用火焰灼烧到达灭菌目旳，合用于 接种器皿旳灭菌。
（6）消毒剂
合用外植体、试验器皿、操作表面、皮肤等。 几种常用消毒剂旳效果比较
消毒剂
乙醇 新洁尔灭 氯化汞
使用浓度(%)
消毒时间 (min.)
效果
70-75 10～20
0.1～1
0.1-3 5～30
2～15
好 好
最 佳
很
残液 清除 难易
C、 塑料器皿旳清洗
聚乙烯、聚丙烯等制成旳塑料器皿，在生物化学 试验中已用旳越来越多。第一次使用塑料器皿时， 可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH = 1）清洗，接 着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗， 然后用10—3 mol/L EDTA 除去金属离子旳污染，最 终用无离子水彻底清洗，后来每次使用时，可只用 0.5％旳去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净 即可。
培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、 生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定 在培养架旳侧面或搁板旳下面，每层有两支日光灯，距 离在20cm，光照强度为2023-3000lx。
2．辅助试验室
2.1鉴定室
细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定 和研究。要求清洁、明亮、干燥，使多种光学仪器 不受潮湿和灰尘污染。应配置多种显微镜、摄影系 统等。
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压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清 洗和大量无菌水冲洗等措施。
• 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、
来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药 品处理。
• 这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的
适当选用。
• 1．培养基用湿热灭菌
• 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序 • 按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。
• 7. 植物材料表面用消毒剂灭菌
• 外植体的选择:
• 外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件
的反应不一样；
• 取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集； • 器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高
的形态发生能力；
• 外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。
• 外植体的灭菌方法:
5～30 5～30 5～30
去除的 效果 难易
易
很好
易
很好
易
很好
氯化汞
0.1-10g/l
2-10
较难 最好
乙醇
700-750ml/l 0.2-2
易
好
过氧化氢
100-120ml/l 5-15
最易 好
溴水
10-20ml/l
2-10
易
很好
抗菌素
4～50mg/L 30～60
中
较好
接种
接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经 切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。
• D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材
料进行适当的切割。
• E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培
养基上。
培养
• 培养：指把培养材料放在培养室（有光照、
温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成 愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
• （一）培养方法
• 1．固体培养法 • 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用
• 接种前后的程序：
• A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫
外灯照射表面灭菌15-20分钟，然后通风20分钟；
• B：手要洗净，用75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒
精擦手；
• C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦
杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲 洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸 上。
不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、 霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、 物品上还有活着的微生物。
• 而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）
和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活 着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌 操作。
• 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。 • 物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高
数计算方法
灭菌
• 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首
先要清楚有菌和无菌的范畴。
• 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、
杀死物体表面和孔隙
内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部 杀死。
• 消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之
的消毒液种类，涮洗3～10次左右。
• 常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸
馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽 量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。
灭菌剂
次氯酸钙 次氯酸钠 漂白粉
使用浓度
90-100g/l 5-20g/l 饱和溶液
持续时间(min)
的方法 。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速 度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。
• 2．液体培养法 • 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液
体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以 确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养， 其速度一般为50～100转／分，这种定期浸没的方法，既能 使培养基均一，又能保证氧气的供给。
• （2）熏蒸灭菌
• 用加热焚烧、氧化等方法 ，使化学药剂变为气体状态扩散到空
气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要 把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲
醛。
• 6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌
• 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、
墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％的 酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以 及0.25～１％的新洁尔灭也可以。
• 3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌
• 干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生
物。通常采用170 ℃持续90分钟来灭菌。
• 4. 不耐热的物质采用过滤灭菌
• 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生
素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌 方法-防细菌滤膜 。
• 5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌
• （1）紫外线灭菌
• 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利
用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变 化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～ 300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质 的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射 物以不超过1.2米为宜。
植物组织培养的基本方法课件
目的要求
• 1．一般掌握灭菌和消毒的区别 • 2．掌握灭菌的方法和具体操作过程 • 3．掌握无菌接种的步骤 • 4．掌握外植体的选择、培养方法和步骤 • 5．一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法 • 6．掌握试管苗驯化的基本程序 • 7．一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍
• 植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续
接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做 外植体。
• 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分
仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。
• 第二步是对材料的表面浸润灭菌。 • 第三步是用灭菌剂处理。 • 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用
容器的体积（ml）
２０～５０ ７５～１５０ ２５０～５００
１０００
在121℃灭菌所需最少时间 （min） １５ ２０
２５
３０
• 2. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
• 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精
中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立 即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的 酒精，以便插入工具。
• 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、
来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药 品处理。
• 这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的
适当选用。
• 1．培养基用湿热灭菌
• 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序 • 按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。
• 7. 植物材料表面用消毒剂灭菌
• 外植体的选择:
• 外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件
的反应不一样；
• 取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集； • 器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高
的形态发生能力；
• 外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。
• 外植体的灭菌方法:
5～30 5～30 5～30
去除的 效果 难易
易
很好
易
很好
易
很好
氯化汞
0.1-10g/l
2-10
较难 最好
乙醇
700-750ml/l 0.2-2
易
好
过氧化氢
100-120ml/l 5-15
最易 好
溴水
10-20ml/l
2-10
易
很好
抗菌素
4～50mg/L 30～60
中
较好
接种
接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经 切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。
• D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材
料进行适当的切割。
• E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培
养基上。
培养
• 培养：指把培养材料放在培养室（有光照、
温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成 愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
• （一）培养方法
• 1．固体培养法 • 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用
• 接种前后的程序：
• A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫
外灯照射表面灭菌15-20分钟，然后通风20分钟；
• B：手要洗净，用75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒
精擦手；
• C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦
杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲 洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸 上。
不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、 霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、 物品上还有活着的微生物。
• 而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）
和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活 着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌 操作。
• 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。 • 物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高
数计算方法
灭菌
• 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首
先要清楚有菌和无菌的范畴。
• 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、
杀死物体表面和孔隙
内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部 杀死。
• 消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之
的消毒液种类，涮洗3～10次左右。
• 常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸
馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽 量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。
灭菌剂
次氯酸钙 次氯酸钠 漂白粉
使用浓度
90-100g/l 5-20g/l 饱和溶液
持续时间(min)
的方法 。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速 度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。
• 2．液体培养法 • 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液
体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以 确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养， 其速度一般为50～100转／分，这种定期浸没的方法，既能 使培养基均一，又能保证氧气的供给。
• （2）熏蒸灭菌
• 用加热焚烧、氧化等方法 ，使化学药剂变为气体状态扩散到空
气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要 把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲
醛。
• 6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌
• 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、
墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％的 酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以 及0.25～１％的新洁尔灭也可以。
• 3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌
• 干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生
物。通常采用170 ℃持续90分钟来灭菌。
• 4. 不耐热的物质采用过滤灭菌
• 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生
素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌 方法-防细菌滤膜 。
• 5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌
• （1）紫外线灭菌
• 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利
用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变 化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～ 300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质 的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射 物以不超过1.2米为宜。
植物组织培养的基本方法课件
目的要求
• 1．一般掌握灭菌和消毒的区别 • 2．掌握灭菌的方法和具体操作过程 • 3．掌握无菌接种的步骤 • 4．掌握外植体的选择、培养方法和步骤 • 5．一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法 • 6．掌握试管苗驯化的基本程序 • 7．一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍
• 植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续
接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做 外植体。
• 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分
仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。
• 第二步是对材料的表面浸润灭菌。 • 第三步是用灭菌剂处理。 • 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用
容器的体积（ml）
２０～５０ ７５～１５０ ２５０～５００
１０００
在121℃灭菌所需最少时间 （min） １５ ２０
２５
３０
• 2. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
• 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精
中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立 即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的 酒精，以便插入工具。