-内酰胺酶的分类及检测
产超广谱β内酰胺酶细菌感染防治专家共识
产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家委员会超广谱β-内酰胺酶（β）是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要机制之一，其预防与治疗已成为临床医生需要面对的重要问题［1］，但国内外缺少相关问题处理的指导性意见。
《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》编辑部和《医学参考报·感染病学频道》编辑部组织国内部分专家制定本《共识》，以对相关问题的处理提供指导。
一、超广谱β-内酰胺酶及相关概念1．β-内酰胺酶及分类：β-内酰胺酶是指细菌产生的能水解β-内酰胺类抗菌药物的灭活酶，是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。
其分类见表1。
2．超广谱β-内酰胺酶：细菌在持续的各种β-内酰胺类抗菌药物的选择压力下，被诱导产生活跃的及不断变异的β-内酰胺酶，扩展了其耐受头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等第3代及第4代头孢菌素，以及氨曲南等单环β-内酰胺类抗菌药物的能力，这些新的β-内酰胺酶被称为。
属于分类的Ａ类和Ｄ类酶，按分类属2。
根据质粒所携带编码基因同源性的不同，主要有、、、型。
还有一些少见的型别，如、、、、、等。
引起临床感染的产β-内酰胺酶细菌依次为肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等。
二、产细菌感染的流行因素及发展趋势自1982年在英格兰首先发现产克雷伯菌后，产细菌的流行在世界各地广泛报道。
主要存在于临床分离的革兰阴性杆菌，其中又多见于肠杆菌科细菌［2-4］。
在肠杆菌科细菌中以大肠埃希菌和克雷伯菌最为常见，克雷伯菌包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌。
其他常见产细菌有产气肠杆菌、变形杆菌、沙门属菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属等。
各个国家和地区产细菌的发生率明显不同。
日本、荷兰等国家产细菌的发生率很低，而法国、印度等国家产细菌的发生率很高，可有高达50％以上的克雷伯菌属的细菌产生，而且具有较严重的耐药性。
我国大陆不同研究者报告的产细菌发生率各有不同，大肠埃希菌发生率大约在40％，肺炎克雷伯菌发生率更低一些。
B-内酰胺酶的检测方法
（是否产生抑菌圈）
1 ＋ － － 有
2 ＋ － ＋ 有
3 ＋ ＋ － 无
4 ＋ ＋ ＋ 有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在
自陆桥。
1.3 试剂 试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4 主要仪器 牛津杯（外径8mm）
2 方法
2.1 预试验
2.1.1 抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。
2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
金属β-内酰胺酶综述
金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。
金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。
酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。
底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。
金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。
一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。
20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。
这些酶都由染色体基因编码。
该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。
1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。
现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。
AmpC酶的检测方法及在临床耐药菌检测中的意义
AmpC酶的检测方法及在临床耐药菌检测中的意义抗生素耐药性问题已成为全球关注的焦点，而我国又是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，因此，有必要加强对细菌耐药性的检测、监测，才能及时发现并控制耐药菌的传播。
目前，对于耐药菌产生的重要β-内酰胺酶—超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），大家有比较深入的认识，其检测技术也日趋成熟，但是对于在革兰氏阴性杆菌耐药中扮演着同样重要角色的酶—AmpC酶却了解甚少。
1 什么是AmpC酶AmpC酶属Ambler分类中的C组酶，其基因为ampC而得名。
AmpC酶是由细菌染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶，其作用于头孢菌素，且不被克拉维酸所抑制，故AmpC酶又称为头孢菌素酶。
染色体介导的AmpC酶可被β-内酰胺类抗生素诱导，属于诱导酶。
质粒介导的AmpC酶（pAmpC酶）与前者不同，pAmpC酶高水平持续表达，且可通过转化、接合等方式转移给其它菌种，造成耐药性的广泛传播。
1989年韩国首次报道发现一种质粒介导的AmpC酶（CMY-1），1990年在美国发现另一种pAmpC酶（MIR-1），目前已有20多种pAmpC酶被陆续报道。
根据AmpC酶的遗传学关系，可将pAmpC酶分为5个家族：（1）枸橼酸杆菌起源的LAT族；（2）未知起源的FOX族；（3）阴沟肠杆菌起源的Entb族；（4）摩根摩根菌起源的Morg族；（5）蜂房哈夫尼起源的Haf族 [1]。
根据AmpC酶的产生方式又可将其分为3类：诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。
（1）诱导高产酶：AmpC酶的合成往往与β-内酰胺类抗生素的存在有关。
大部分肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌在无β-内酰胺类抗生素存在的条件下只产生少量的AmpC酶。
当有诱导作用的β-内酰胺类抗生素存在时，AmpC酶的产量明显增加。
（2）持续高产酶：即产AmpC酶的菌株无论在有无β-内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC酶，其原因为去阻遏突变。
超广谱β-内酰胺酶的检测及耐药性分析
超广谱β-内酰胺酶的检测及耐药性分析莫志航;宁炎【摘要】目的了解临床产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的发生率、耐药性,以便于对ESBLs进行监测和治疗.方法对102株E.coli和78株K.pneumoniae采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)规定的ESBLs表型筛选和确证试验确定ESBLs的发生率,并检测产ESBLs的E.coli 和K.pneumoniae的耐药性.结果 13.7％ (14/102)的大肠埃希菌和26.9％ (21/78)的肺炎克雷伯菌产ESBLs;产ESBLs菌株对亚胺培南耐药率为0％,除对阿米卡星、头孢西丁、替卡西林/克拉维酸联合酶抑制剂耐药率较低外,对三代头孢菌素、磺胺类和喹诺酮类药物均出现较高耐药.结论对产ESBLs菌株引起的感染,亚胺培南为首选.%Objective To investigate the prevalence of strains producing extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) among Escherichia coil and Klebsiella pneumoniae, and to determine the drug resistance of the strans for better control and treatment of ESBLs. Methods One hundred and two strains of E. coli and 78 strains of K. pneumoniae were investigated for production of ESBLs by phenotypic screening and confirmatory test provided by the NCCLS. The drug resistance of ESBLs-producing strains was also investigated. Results 13.7% (14/102) of E. coli and 26.9% (21/78) of K. pneumoniae investigated were found to produce ESBLs. All ESBLs-producing strains were found to be susceptible to imipenem, relatively lowly resistant to of amikacin, cefoxitin, cefoperazone/β-lactamase inhibitor com-binations, and highly resistant to third generation cephalosporins, sulfonamides and quinolones. Conclusion Imipen-em isthe premium antibiotics for the treatment.of infection caused by ESBLs-producing strains.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2012(023)018【总页数】2页(P78-79)【关键词】超广谱β-内酰胺酶;大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌;耐药性【作者】莫志航;宁炎【作者单位】增城市新塘医院检验科,广东增城511340;增城市新塘医院检验科,广东增城511340【正文语种】中文【中图分类】R446超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)主要由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生，能水解青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类抗生素，从而使之失效[1]。
β-内酰胺酶的分类
β-内酰胺酶的分类
β-内酰胺酶可以分为四类：
1. 类A β-内酰胺酶：这是最常见的β-内酰胺酶，它能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。
这些酶通常由革兰阴性菌产生。
2. 类B β-内酰胺酶：这些酶也称为金属β-内酰胺酶，因为它们需要金属离子（通常是锌）来发挥催化作用。
这些酶能够降解第二代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素。
类B β-内酰胺酶主要由革兰阴性菌产生。
3. 类C β-内酰胺酶：这些酶主要由革兰阳性菌产生，能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。
类C β-内酰胺酶通常不会降解第二代头孢菌素和第三代头孢菌素。
4. 类D β-内酰胺酶：这些酶由革兰阳性菌产生，能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。
类D β-内酰胺酶通常不会降解第二代头孢菌素和第三代头孢菌素。
β—内酰胺酶的分类
β—内酰胺酶的分类
一、β-内酰胺酶的分类
1、 Glycoside hydrolase（糖苷酶）
糖苷酶可将葡萄糖（即糖苷）的苷酸与醣之间的键断裂，产生一个葡萄糖分子，以及一种带有醣残基的糖苷。
糖苷酶中包括了α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和神经氨酸苷酶。
2、 Glycosyltransferases（糖基转移酶）
这种酶可在糖与糖之间及芳香醛与糖之间转移糖基，可用来合成多糖，碳酸酐和糖苷。
3、 Glycogen hydrolases（糖原酶）
糖原酶可将糖原的α-1,4-糖链和α-1,6-糖链断裂，而产生的产物是葡萄糖和糖原残基。
4、 Glycosynthases（糖酰肽酶）
糖酰肽酶可将糖基与肽中的氨基酸链接，是O-糖肽和C-糖肽合成所必需的酶。
5、 Peptidoglycan hydrolase（多肽多糖酶）
多肽多糖酶可以降解多糖多肽中的糖链，是拟菌素类抗生素的有效靶标。
6、 Hydrolases of synthetic polysaccharides（合成多糖酶）
合成多糖酶可以解除各种合成多糖分子之间的糖链，是多糖品种分解和利用的关键酶。
- 1 -。
检验科细菌耐药性监测标准操作程序SOP文件
检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。
（一）MRS测定方法1、纸片扩散法接种物：直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。
苯唑西林纸片，1R g/片，检测MRS平板应置于35℃ （而不是37℃）孵育24h （而不是16〜18h）。
结果判断：金黄色葡萄球菌：S：三13mm；I：11〜12mm；R:W10mm。
凝固酶阴性葡萄球菌：S：三18mm；R W17mm。
对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。
2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6R g/ml苯唑西林+4%NaCl,调整菌液浓度0.5McFarland,于35℃孵育24h,凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。
（二）MRS监测意义对于MRS,应报告对所有头抱菌素类和其他B -内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10〜23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。
二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）（一）药敏测定方法1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头抱菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，万古霉素一定要做。
2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：⑴高含量纸片扩散法：通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。
药敏纸片：庆大霉素：120R g/片；链霉素300p g/片结果判断：R：W6mm；I：7~9mm；S：三10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：稀释法：庆大霉素：R：三500R g/ml；链霉素：R：2000p g/ml3、万古霉素耐药性测定：纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30p g/片，检测平皿置35℃24h （而不是16〜18h）,并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。
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亚分类 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3b 3b 3b 3b 3b 3b 3c 3a
物学亚类 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 B3
酶的型别 宿主 发现国家 发现时间 CcrA3 脆弱拟杆菌 美国 1994 CcrA4 脆弱拟杆菌 美国 1994 CcrA 脆弱拟杆菌 美国 1986 PCM-1 洋葱假单胞菌 未知 1994 IMP-1 铜绿假单胞菌 日本 1991 IMP-2 不动杆菌属 意大利 1999 IMP-3 铜绿假单胞菌 日本 2000 IMP-4 不动杆菌属 香港 2001 杨氏枸橼酸杆菌 中国 2001 IMP-6 粘质沙雷菌 日本 2001 IMP-7 铜绿假单胞菌 加拿大 2002 IMP-8 肺炎克雷伯菌 中国台湾 2001 VIM-1 铜绿假单胞菌 意大利 1999 VIM-2 铜绿假单胞菌 法国 2000 VIM-3 铜绿假单胞菌 台湾 2000 CphA 嗜水气单胞菌 意大利 1993 A2h 嗜水气单胞菌 美国 1990 ACP 嗜水气单胞菌 苏格兰 1996 AsbM1 简达气单胞菌 美国 1990 AsA-1 杀蛙气单胞菌 苏格兰 1994 Imis 温和气单胞菌 英国 1995 戈氏军团菌 1986 L1 嗜麦芽窄食单胞菌 日本 1982
卄 卄 卄
－ 十 卄 十
－ － －
－ － － －
－ － －
－ － － －
－ V －
－
卄 － －
－
－ － －
卄
•Bush-J-M分类策略
•
3组金属酶
头孢菌素酶 酶EDTA 1组 2e组 2a组 2d组
• • • •
•
• • • • • 非金属酶
青霉素 酶
2c 组
2f组 4组 2be 组
广谱酶 2b 2br组
A
B
C
金属酶的三维结构图 A：CcrA（脆弱拟杆菌） B：BcⅡ（蜡样芽胞杆菌） C：L1（嗜麦 芽窄食单胞菌） 园柱代表α螺旋，板片代表β片层 绿色数字为His残基，兰灰色数字 为Asp残基，橙色数字为Cys或Ser残基。
获得性金属酶 （1）IMP型金属酶 （2） VIM型金属酶
其他超广谱β-内酰胺酶
CTX-M-型酶 可为分4个小组 PER-1及其相关ESBL PER-1、-2 、VEB-1、2 CME-1 TLA-1 特殊的非典型ESBL SFO-1 、GES-1
TEM型ESBLs
1．Glu140→Lys和Glu240→Lys替换 ：对头孢他啶和氨曲南 耐药 2．Arg164→Ser或His ：对头孢他啶耐药 ，对头孢噻肟敏感
3．Gly238→Ser：主要提高了对头孢噻肟的水解能力（如TEM-19 )
SHV型ESBLs
1. SHV-2型ESBLs： Gly238→Ser，主要提高水解头孢噻肟的能力 2. SHV-5型ESBLs ：同时具有Gly238→Ser和Glu240→Lys突变 3. SHVΩ环突变型ESBLs：Asp179→Ala 、Arg
β-内酰胺酶的分类及检测
复旦大学附属华山医院检验医学中心
蒋晓飞
表2 β-内酰胺酶的结构和功能分类
最适底物 抑制剂 CLAV CLOX EDTA
分子结构 功能
举例
(Ambler) (Bush) PEN CARB OX CR CTX ATM IPM 丝氨酸酶 A 2a PC1，LEN-1 卅 十 － 土 － － － 2b SHV-1,TEM-1 卅 十 十 卄 － － － 2be K1,TEM-3, 卅 十 十 卄 卄 卄 － SHV-2,PER-1 2br TEM-31 卅 十 十 十 － － － 2C PSE-1,BRO-1 卄 卅 十 十 － － － 2e 卄 卄 － 卄 卄 卄 － 2f Sme-1,NMC-A 卄 十 ? 十 十 卄 卄 IMI-1 C 1 AmpC 卄 十 － 卅 十 － － D 2d OXA-1 卄 十 卅 十 － － － 未定 4 AVS-1 卄 卄 卄 V V － － 金属酶 B 3 IMP-1 卄 卄 卄 卄 卄 － 卄 嗜麦芽L-1
分子量 等电点 26 未测 26 未测 26 5.2 未测 8.5 28 9.0 26 8.1 8.0 未测 未测 8.2 5.3 未测 5.1 8.0 8.0 8.2 9.1 >7.9 9. 10.5 6.9
未测 未测 未测 未测 未测 28 28 31 34 19 未测 25 118
B类β-内酰胺酶
A类β-内酰胺酶与B类、C类和D类酶的同源性比较
B类β-内酰胺酶
又称金属β-内酰胺酶，Bush功能分类中属于3组酶，能灭 活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安 曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制剂克拉维酸 和氯唑西林对它无作用 。
金属酶的功能亚分类 ：3a、3b、3c 金属酶的分子生物学亚型分类 :B1、B2、B3
A类β-内酰胺酶
1。 A类β-内酰胺酶：
广谱酶2b组
A
B
A 大肠埃希菌TEM-1型酶结构 ；B 肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶结构
超广谱β-内酰胺酶(2be) 经典超广谱β-内酰胺酶 TEM型ESBLs SHV型ESBLs SHV-2型ESBLs 、SHV-5 型ESBLs SHVΩ环突变型ESBLs
小结
1组酶：头孢菌酶 ，优先水解底物是头孢菌素，它们水解青霉素的 的速率低于水解头孢噻啶的速率的30%，对三代头孢菌素和头霉烯 耐药，但对碳青酶烯和四代头孢菌素较为敏感，对酶抑制剂克拉维 酸和EDTA均不敏感，可被氯唑西林抑制 2组酶：优先水解青霉素类抗生素，其中水解头孢噻啶的速率低于 水解青霉素的速率的30%者为青霉素酶 ，又分为2a、2b、2c、2d、 2e和2 f亚组。 3组酶：又称金属酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类 抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制剂克 拉维酸和氯唑西林对它无作用 。 4组酶：是染色体介导的耐抑制剂的青霉素酶，对头孢类抗生素的 敏感性不定，对氨曲南和碳青霉烯敏感。