基因组文库的构建ppt课件
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功能基因组学课件
《功能基因组学》PPT课件
SAGE 步骤
1. 将5μg含有oligo dT（引物）的磁珠与 RNA混合。
2. 合成双链cDNA。
3. 用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签 的产物。
4. 将样品分成两份，连接成含有识别序 列的产物，以备用BsmF1消化。
5. 用Mme I切割每一个样品形成约60bp 的标签。
➢ 科学研究已开始进入“后基因组时代”。主要是开展 功能基因组学和蛋白质组学的研究。
➢ 有科学家形象地说道：即使基因测序全部完成，也只 好像是一本没有姓名，只有号码的电话簿。“后基因 组时代”的最终目标，是要把深奥的DNA语言变成一 本大基因百科全书。
《功能基因组学》PPT课件
功能基因组学
功能基因组学，后基因组学(Post genomics)： 利用结构基因组学提供的信息和产物 通过在基因组或系统水平上全面分析基因的 功能 生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转 向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。
特定基因检测 突变检测 多态性分析 基因表达谱
• 生物信息学的工具 • 基因相关性研究 • 基因功能 • 药物设计和开发 • 潜在反义试剂开发 • 个体化医疗 • 身份识别 • 基因诊断 • 其他与生物有关的领域
《功能基因组学》PPT课件
例：肿瘤诊断
国外有一临床病人表现出典型的白血病症状，但形态 学检测不典型，根据相关检查，诊断为AML（acute myeloid leukaemia, 急性骨髓白血病），治疗几个月后未见 好转。后来用DNA芯片与病人骨髓的mRNA杂交，结果显示 AML和ALL(acute lymphoblastic leukaemia 急性成淋巴细胞白 血病)基因都表达较低，而在数据分析中发现，编码原肌球 蛋白的基因表达极高，从而确诊为肺泡弹状肌肉瘤，改变 治疗方案，病情出现缓解。
SAGE 步骤
1. 将5μg含有oligo dT（引物）的磁珠与 RNA混合。
2. 合成双链cDNA。
3. 用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签 的产物。
4. 将样品分成两份，连接成含有识别序 列的产物，以备用BsmF1消化。
5. 用Mme I切割每一个样品形成约60bp 的标签。
➢ 科学研究已开始进入“后基因组时代”。主要是开展 功能基因组学和蛋白质组学的研究。
➢ 有科学家形象地说道：即使基因测序全部完成，也只 好像是一本没有姓名，只有号码的电话簿。“后基因 组时代”的最终目标，是要把深奥的DNA语言变成一 本大基因百科全书。
《功能基因组学》PPT课件
功能基因组学
功能基因组学，后基因组学(Post genomics)： 利用结构基因组学提供的信息和产物 通过在基因组或系统水平上全面分析基因的 功能 生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转 向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。
特定基因检测 突变检测 多态性分析 基因表达谱
• 生物信息学的工具 • 基因相关性研究 • 基因功能 • 药物设计和开发 • 潜在反义试剂开发 • 个体化医疗 • 身份识别 • 基因诊断 • 其他与生物有关的领域
《功能基因组学》PPT课件
例：肿瘤诊断
国外有一临床病人表现出典型的白血病症状，但形态 学检测不典型，根据相关检查，诊断为AML（acute myeloid leukaemia, 急性骨髓白血病），治疗几个月后未见 好转。后来用DNA芯片与病人骨髓的mRNA杂交，结果显示 AML和ALL(acute lymphoblastic leukaemia 急性成淋巴细胞白 血病)基因都表达较低，而在数据分析中发现，编码原肌球 蛋白的基因表达极高，从而确诊为肺泡弹状肌肉瘤，改变 治疗方案，病情出现缓解。
怎样构建基因组文库
E 与载体相连
2
1
甲基化酶 人工接头I REI
人 工 接 头 II
REII 与载体相连 3 重 组 cDNA
ds-DNA合 成
与 SalI匹 配 接头相连
NotI酶 切
cDNA的定向插入
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA
ligase
NotI primer/adaptor SalI adaptor
P o ly A 3 1
51
GGG
M o d ifie d o lig o (d T ) P rim e r
F irst-stra n d sy n th e sis c o u p le d w ith (d C ) ta ilin g b y R T
51
GGG CCC
p o ly A
T e m p la te sw itc h in g a n d e x te n sio n b y R T
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后,它会在第一 链的3’端加上几个C; 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第 二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR
S M A R T M eth o d
P o ly A + R N A
2. Okayama–Berg改进法
该法集中了常规方法和 Okayama–Berg法的优点,第 一条cDNA链合成用常规法， 但在3’-端加尾后，其余步 骤与Okayama–Berg法相同
UC19
1)Pst I 2)TdT+dGTP
GGGG GGGG
Sma I
CCCC
GGGG
2
1
甲基化酶 人工接头I REI
人 工 接 头 II
REII 与载体相连 3 重 组 cDNA
ds-DNA合 成
与 SalI匹 配 接头相连
NotI酶 切
cDNA的定向插入
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA
ligase
NotI primer/adaptor SalI adaptor
P o ly A 3 1
51
GGG
M o d ifie d o lig o (d T ) P rim e r
F irst-stra n d sy n th e sis c o u p le d w ith (d C ) ta ilin g b y R T
51
GGG CCC
p o ly A
T e m p la te sw itc h in g a n d e x te n sio n b y R T
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后,它会在第一 链的3’端加上几个C; 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第 二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR
S M A R T M eth o d
P o ly A + R N A
2. Okayama–Berg改进法
该法集中了常规方法和 Okayama–Berg法的优点,第 一条cDNA链合成用常规法， 但在3’-端加尾后，其余步 骤与Okayama–Berg法相同
UC19
1)Pst I 2)TdT+dGTP
GGGG GGGG
Sma I
CCCC
GGGG
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
微生物基因组学 ppt课件
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PPT课件
六、研究基因组功能的意义 1． 加速致病基因的研究 2． 寻找灵敏而特异性的病原分子标记 病原微生物的特异性DNA序列可以作为分子标记用于疾病的诊断。 3． 促进新药的发现和疫苗的发展 （1）促进新药的发现 （2）疫苗的研究 4． 促进微生物分类的发展
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PPT课件
5. 提高对人类相关基因功能的认识
（1）一些人类的遗传性疾病，如结肠癌、肝豆状核变性、肾上腺脑白质 营养不良等，在细菌的基因组分析中，也存在类似的蛋白物。
（2）可以利用微生物做模拟，去检测高等生物的基因性状和功能。 （3）从基因水平去揭发人类疾病与病原微生物之间关系，如发病机理， 人类与病原微生物之间相互作用的基因机理等。
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PPT课件
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三．微生物基因组的注释 （一）概念：在微生物基因测序的基础上，对其基本 结构和部件进行认定，以进一步研究其功能。
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（二）微生物基因组注释的内容 1.碱基组成分析，即G+C Mol%测定。 G+C含量是物种的一个重要特征，在微生物的分类上具有重要意义，是 重要参数之一。 2．开放阅读框的鉴定： 3．编码序列分析
消化 （4）分子杂交 （5）Southern十字杂交法
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五、微生物基因组功能分析 1、根据目的基因组的性状而推测可能的基因组功能。 如致病岛的G+C mol%与细菌本身的G+C mol%有很大差异。致病岛或耐 药岛等。 2、根据已知的数据库进行同源性搜索。 美国NIH的GenBank；欧洲的分子生物学实验数据库（FMBL）日本的 DNA数据库(DDBJ) 3、利用不同条件、不同作用因素的影响而鉴定未知基因的功能。 如用过氧化氢酶处理沙门氏菌而获得该菌的对H2O2氧化应激反应的基因。 4、采用基因敲除的方法来推测或确定基因的功能。
第五章基因组测序技术(共118张PPT)
从下到上依次读出DNA 片段的核苷酸序列
断裂产物分 别在4个泳 道电泳
G G+A T+C C
化学法测序实例
哌啶
改进的特异化学切割反应
1.基本原理
与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延 伸反应。
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异 性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一 种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶 活性。
制备单链模板
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行
序列组装，排成重叠克隆群.
基于克隆群(contig-based)
鸟枪法策略
指导测序策略
遗传、物理图谱
人们对感兴趣的基因或与疾病相关的 基因优先测序.
如:人类主要组织相容性复合区位于第6号 染色体,与人类免疫系统有关，因而优先 测序.
EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很 容易从 cDNA中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其
2. 人类基因组草图的完成
2000年6月26日是人类 上值得纪念的一天。人 类基因组的工作草图已 经绘制完毕并于这天向 全世界公布。最终完成 图要求测序所用的克隆 能忠实地代表常染色体 的基因组结构，序列错 误率低于万分之一。
断裂产物分 别在4个泳 道电泳
G G+A T+C C
化学法测序实例
哌啶
改进的特异化学切割反应
1.基本原理
与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延 伸反应。
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异 性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一 种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶 活性。
制备单链模板
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行
序列组装，排成重叠克隆群.
基于克隆群(contig-based)
鸟枪法策略
指导测序策略
遗传、物理图谱
人们对感兴趣的基因或与疾病相关的 基因优先测序.
如:人类主要组织相容性复合区位于第6号 染色体,与人类免疫系统有关，因而优先 测序.
EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很 容易从 cDNA中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其
2. 人类基因组草图的完成
2000年6月26日是人类 上值得纪念的一天。人 类基因组的工作草图已 经绘制完毕并于这天向 全世界公布。最终完成 图要求测序所用的克隆 能忠实地代表常染色体 的基因组结构，序列错 误率低于万分之一。
基因组学ppt课件
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染色体带型命名
人类染色体带型最早确定的命名方式是从着丝粒向两侧按数字编号, 短臂以p代表 (p=petit),长臂以q代表. 短臂和长臂又可进一步分区，每个区又分为数个亚区， 亚区又可划分为不同的区带，有的区带又可细分为区亚带。
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7
人类染色体核型
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8
四、基因组的结构成分
1) SAR和MAR 2) CpG岛 3) 等高线
5) MAR或SAR之间的距离平均为30 kb, 染色体DNA环突
长约25-600 kb, 因此并非所有MAR或SAR均与基质或
骨架结合. 或这说MAR(或SAR)与基质或骨架结合的
位置是动态的, 不固定的.
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SAR和MAR的应用
由于发现许多功能基因的两侧含有SAR或 MAR的结构,并证实SAR和MAR具有阻止 异染色质位置效应和隔离相邻基因彼此干 扰的功能, 因此为了提高转基因的表达水平, 在构建表达载体时可在基因两侧安装SAR 或MAR顺序, 以减少转基因沉默效应.
编辑课件
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MAR
的 分 离
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（2）什么是CpG岛
满足CpG岛的条件为: 1. 连续200 bp的DNA顺序(已修改为500 bp); 2. C+G含量大于50%(已修改为55%); 3. 观测到的CpG双碱基数目与预期的数目
之比大于0.6(已修改为0.65).
(Gardiner-Garden, J.Mol.Bio., 196:261, 1987; Proc Natl Acad Sci USA 99:3740-3745, 2002 )
第6章 真核生物基因组解剖
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基因工程研究PPT课件
基因工程研究
体外 操作 与细 胞内 表达
(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
(一)目的基因的分离(分)
目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达 的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略
同 源 多 聚 尾 连 接 法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆 菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞(Competent Cell)的制备:用特殊方法处理,使细胞膜通透 性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程:感受态细胞和重组DNA混合,使DNA与钙离子形成复合物, 吸附于细胞表面,经42℃短暂(90s)的热处理,促进外源DNA进入感受态 细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆 菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插 入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性, 可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整 合到受体染色体而获得稳定的表达。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无 法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核 苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的 基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添 加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连 接酶连接。
体外 操作 与细 胞内 表达
(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
(一)目的基因的分离(分)
目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达 的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略
同 源 多 聚 尾 连 接 法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆 菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞(Competent Cell)的制备:用特殊方法处理,使细胞膜通透 性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程:感受态细胞和重组DNA混合,使DNA与钙离子形成复合物, 吸附于细胞表面,经42℃短暂(90s)的热处理,促进外源DNA进入感受态 细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆 菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插 入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性, 可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整 合到受体染色体而获得稳定的表达。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无 法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核 苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的 基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添 加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连 接酶连接。
第7章 基因文库的构建
cDNA 只能反映基因表达的转录及加工后的 mRNA 产物所携带的信息 , 也即 cDNA 序列只与 基因的编码序列有关 , 不能反映基因的内含 子 , 也不能反映基因的转录启动子和终止子 等,所以cDNA便于克隆及大量扩增,构建的文 库复杂性低 , 库中总的克隆数较少，则从中筛选
特异基因比较容易，但由于插入片段较 长，以后的分析比较困难。
因为基因组DNA片段是随机克隆的，所以基因组大小除以
克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角
度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率 只有50%。当克隆数增A数
细胞中某种mRNA的拷贝数
例如 某细胞的总mRNA数为500500个
如 获 得 丰 度 为 每 细 胞 3500 拷 贝 (14 拷 贝 ) 的 mRNA 基 因 , 应 构 建 的 文 库 的 最 小 值 为 500500/3500 (14) =143 (35750) ;
通常选质粒载体或噬菌体载体。
以 质 粒 为 载 体 构 建 文 库 示 意 图 cDNA
以 λ 噬 菌 体 作 载 体 构 建 cD织中,并 非所有的基因都表达,通常表达的基因 仅占基因总数的15%,产生出约15000种 不同的mRNA分子,因此在mRNA水平上分 离目的基因,可以大大地缩小搜寻目的 基因的范围,降低分离目的基因的难度.
真核生物mRNA分子的3`端有多聚腺核苷酸组成 的poly(A)尾巴，这种特性为分离纯化mRNA分子 提供了方便。
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成cDNA构建时载体的选择：由于绝大多数真核生物的mRNA00) 个克隆子组成的cDNA文 库中应包含1个如此