物理因素对细菌的影响
微生物实验 细菌的培养及消毒与灭菌
固体斜面接种法 液体培养基接种法
细菌的分离接种法
平行划线接种法: 被检标本中菌量少
分区（四分区）划线接种法: 被检标本中菌量多
菌苔
固体培养基中的琼脂 平板培养基，经平板 划线分离培养，可见 单个菌落。
菌落
菌苔
细菌的纯培养
琼脂斜面接种法:
肉膏汤接种法
肉膏汤接种法
半固体穿刺法
【实验内容二】消毒与灭菌
1. 熟悉常用的物理、化学消毒灭菌法。 2. 了解微生物的分布。
【实验内容与方法】
1. 物理因素对细菌的影响─紫外线杀菌实验。 2. 化学因素对细菌的影响─皮肤消毒实验。
1.物理因素对细菌的影响─紫外线杀菌实验
细菌 黑纸片
紫外灯下垂直照射30分 钟后， 37℃温箱培养18-24h
实验三 细菌的培养及消毒灭菌
【目的要求】
1.掌握细菌的分离接种及纯培养的方法观察其生长现象。 2.熟悉常用的物理、化学消毒灭菌法。 3.了解微生物的分布。
病原生物学与免疫学教研室
【实验内容一】细菌的培养
1.培养基的概念及种类。
2.培养基的制备
调配
溶化
调pH
过滤
分装
灭菌
鉴定
3.细菌的分离培养法
平行划线法 分区（四分区）划线法
细菌Leabharlann 2.化学因素对细菌的影响─皮肤消毒实验
未消毒手指接 触培养基
1
2
5
4
3
75%酒精 1分钟
流动水洗手指 接触培养基
口腔中的微生物
环境中的微生物
【实验报告】
1.记录： 四分区划线接种 琼脂斜面接种法 方法及生长现象 肉膏汤接种法
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
实验十四物理和化学因素对微生物的影响
6、观察 观察并记录培养基平板上的表皮葡萄球菌生长情况。
每毫升菌 同 液一 中稀 3 次 总释 重 活浓 复 菌度 的 数 稀 菌 释 5 落 倍 平 数 均数
实验步骤
1、倒平板 将牛肉膏蛋白胨培养基制成平板。
2、接种 用无菌移液管取0.2ml表皮葡萄球菌菌液于平板上，并用涂布 棒涂布均匀。
实验报告
请比较不同化学药剂对表皮葡萄球菌的致死能力，并 将结果填入下表。
表1 不同化学药物对表皮葡萄球菌的致死能力
药剂
抑菌圈直径(mm)
2.5%碘酒
0.05%龙胆紫
0.5% 84消毒液
0.25%新洁尔灭
1、倒平板
1、倒平板
将牛肉膏蛋白胨培养基制成平板。 将牛肉膏蛋白胨培养基制大小，比较几种化学药剂的杀菌力强弱。
球菌生长情况。
实验十三 物理化学因素对微生物的
影响
目的要求
了解不同物理因素对微生物生 长的影响及其实验方法。
了解常用化学药剂对微生物的 作用原理及其实验方法；
基本原理
温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。当微生物处 于最适生长温度时，其生长速度最快；不适宜的温度可以导 致细菌形态和代谢的改变或使微生物的蛋白质凝固变性而导 致菌体死亡。
根据微生物对氧的要求不同可将微生物分为专性好氧菌、兼 性厌氧菌、微好氧菌、耐氧菌和专性厌氧菌五种类型。
紫外线对微生物生长的影响随照射剂量、时间和照射距离的 变化而不同，剂量大、时间长、距离短时易杀死微生物；剂 量小、时间短、距离长时就会有少量个体残存下来，某些个 体会发生变异。
O2对微生物的影响
1好氧菌；2 厌氧菌；3 兼性厌氧/耐氧菌；4 微好氧菌
实验八 物理、化学因素对微生物的影响
实验八物理、化学因素对微生物的影响1 目的1.1 观测氧气、温度、紫外线对微生物生长的影响1.2 认识细菌芽孢对热、紫外线的抗力2 原理环境因素包括物理因素、化学因素和生物因素，不良的环境条件使微生物的生长受到抑制，甚至导致菌体的死亡。
但是某些微生物产生的芽孢，对恶劣的环境条件有较强的抵抗能力。
我们可以通过控制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至被杀死；而对有益微生物，通过调节理化因素，使其得到良好的生长繁殖或产生有经济价值的代谢产物。
根据微生物对氧气的需求，可把微生物分为好氧菌、厌氧菌和兼性好氧菌。
在鉴定细菌时，常以它们的好氧性作为指标。
温度是影响微生物生长的重要因素之一。
根据微生物生长的最适温度范围，可分为高温菌、中温菌和低温菌，自然界中绝大部分微生物属于中温菌。
紫外线主要作用于细胞内的DNA，轻则使微生物发生突变，重则造成微生物死亡。
紫外线照射的剂量与所用紫外光灯的功率(瓦数)、照射距离和照射时间有关。
紫外线透过物质的能力弱，一层黑纸足以挡住紫外线的通过。
3 材料3.1 菌种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷氏菌。
3.2 培养基肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、麦芽汁葡萄糖培养基、察氏培养基。
3.3 其他物品培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅、紫外线灯、黑纸、试管、接种针、温箱、刮铲、吸管、调温摇床、分光光度计。
（一）物理因素对微生物生长的影响1 氧气对微生物生长的影响1.1 流程半固体培养基→接种→培养→观察比较→记录结果1.2 步骤1.2.1制备试管培养基依据培养基配方制作肉膏蛋白胨半固体培养基，灭菌备用。
1.2.2接种与培养取上述试管7支，用穿刺接种法分别接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和丙酮—丁醇梭菌，每种菌接种2支培养基试管，剩余一支作为空白对照。
注意：穿刺接种到上述培养基中时，必须穿刺到管底。
在37℃恒温箱中培养48h。
1.2.3观察结果取出试验样品，观察各菌株在培养基中生长的部位。
物理因素对细菌的影响
温度、光线、干燥、超声波、过滤等因素均可影响细菌的新陈代谢及其化学组成，故常选用一些物理方法达到消毒和灭菌的目的。
（一）温度各种细菌都需在最适生长温度的范围内生长。
当外界温度明显高于最适生长温度，细菌被杀死；如果在低于细菌的最低生长温度时，细菌代谢活动受抑制，则出现抑菌作用。
1.高温：细菌蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍导致细菌死亡。
大多数无芽胞细菌55℃～60℃加热30～60min即被杀死；加热100℃立即死亡，有芽胞的破伤风芽胞梭菌需煮沸3h才被杀死。
热力灭菌分湿热和干热两种。
在同一温度下，前者的效力大于后者。
（1）湿热：常用的方法有1）巴氏消毒法：方法有两种：一是61.1℃～62.8℃30min；另一是71.7℃l5～30s，目前主要用于牛乳消毒。
2）煮沸法：煮沸l00℃（1个大气压状态下）。
5min中可杀死细菌繁殖体，如于水中加入2％碳酸钠，则可提高其沸点至105℃，既杀死芽胞，又防止金属器皿生锈。
3）流通蒸气灭菌法：常用阿诺（Arnold）流通蒸气灭菌器或蒸笼。
利用一个大气压下l00℃水蒸气进行消毒。
经10～30min细菌繁殖体被杀死，但对芽胞的作用不大。
4）间歇灭菌法：采用间歇加热方式达到灭菌目的。
方法是将待灭菌物品置于Arnold灭菌器内，经l00℃加热15～30min，每日一次，连续3次。
每次灭菌后，取出再置37℃孵箱过夜，使残存的芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸气加热使之被杀死。
这样可达到杀死芽胞又使不耐100℃的物质保存下来。
5）加压蒸汽灭菌法：利用密闭的耐高压的高压蒸汽灭菌器，在蒸汽不外溢的条件下，使锅内压力增高，蒸汽的温度也随之增高，大大加强其杀菌效力。
通常在103.4kPa的压力下达121.3℃，维持15～20min可杀灭所有细菌芽胞和繁殖体。
本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。
（2）干热1）烧灼：是常用的干热灭菌法。
第5篇外界因素对微生物的影响
重金属极其盐类
是杀菌剂和防腐剂，作用最强的是Hg,Ag,Cu,作用机 理：使蛋白质变性，使酶失活。（与E的－SH结合。）
0·02－0·2％Hgcl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。 0·1－1％ AgNO3 可消毒皮肤，1％浓度新生儿点眼预防眼炎 CuSO4对真菌、藻类有强杀伤力，波尔多（CuSO4＋碳）防植物病害 另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药。
微生物的形态、化学组成及新陈代谢等与一定的 外界化学因素密切相关。
各种化学物质对微生物的影响是不相同的，有的可 促进微生物的生长繁殖，有的阻碍微生物新陈代谢的 某些环节而呈现抑菌作用，有的使菌体蛋白质变性或 凝固面呈现杀菌作用。就是同一种化学物质，由于其 浓度、作用时的温度、作用时间的长短以及作用对象 的不同，或呈现抑菌作用，或呈现杀菌作用。
菌体内盐离子浓度升高。
各种微生物对干燥的抵抗力不一样。
多数微生物不耐干燥，常用干法保存草料和食 品类。
当牧草水分降至12-16%，可较长时间保存；
谷物类水分在14%以下，低于30℃可长保存； 若升温置30℃或湿度大于17%，或即使低于 10℃ ，但湿度高于19%，即会生霉。
二、 渗透压：
渗透压与微生物的生命活动有密切关系：
(二)化学物质的浓度
一般认为化学消毒剂的浓度愈大，其对微生物 的毒害作用愈强。但这不等于浓度加倍，杀菌力 也随之增加一倍。如0.5％的石炭酸只能做防腐剂， 而浓度增加到2—5％时，则呈现杀菌作用。消毒 剂浓度的增加是有限度的，超越此限度时，并不 一定能提高消毒效力，有时一些消毒剂的杀菌效 力反而下降，如无水酒精不如70％酒精的杀菌作 用强。
用冷冻法保存食品(肉品、乳品、蛋品及其他食品等)，可 经久不坏。但在冰冻前即被某种病原微生物污染时；因 病原微生物在冰冻的条件下能继续存活，故此种受污染 的冰冻食品更有传播疾病的危险性。
用物理和化学方法控制微生物
用物理和化学方法控制微生物微生物是指单细胞的微小生物体，包括细菌、病毒、真菌和其他原生动物。
它们存在于自然界的各个角落，有些对人类和环境有害，例如致病菌、传染病和食品腐败，因此我们需要采取一些物理和化学方法来控制微生物的增殖和传播。
物理方法是指基于物理特性的方法，可以直接影响微生物的生长和繁殖。
其中之一是热处理，通过加热来杀死微生物。
例如在食品加工中，高温可以杀死细菌和病毒，保证食品的安全。
另一种常用的物理方法是辐射处理，包括紫外线辐射和电离辐射。
紫外线辐射可以破坏微生物的DNA，抑制其生长和复制能力。
电离辐射则能够杀死微生物，包括耐热的孢子。
这些物理方法广泛应用于医疗、食品加工和水处理等领域。
化学方法是指使用化学物质对微生物进行控制的方法。
其中一个常见的化学方法是消毒，使用化学物质杀死或抑制微生物。
消毒剂可以通过破坏微生物的细胞膜、细胞壁或细胞核，从而达到控制微生物的目的。
消毒剂广泛应用于餐具清洗、手部消毒和医疗设备消毒等领域。
另一个重要的化学方法是抗菌药物的使用，通过抑制微生物代谢或干扰其细胞结构来抑制微生物的生长。
然而，抗菌药物的滥用和不合理使用导致抗药性微生物的出现，成为全球性的公共卫生问题。
需要注意的是，尽管物理和化学方法能够有效控制微生物，但它们也可能对环境和人类健康产生一些负面影响。
例如，过度使用抗菌药物可能导致抗药性微生物的出现；高温和辐射处理可能对食品的营养价值和质量造成损害。
因此，在使用这些方法时需要平衡控制微生物的需求和对环境和人类健康的影响。
此外，对于微生物的控制还需要考虑其他因素，例如环境因素、个人卫生和预防措施等。
采取综合性的策略，结合物理、化学和生物学的方法，可以更加有效地控制微生物的增殖和传播，保护人类和环境的健康。
第三章外界环境因素对微生物的影响
冷冻保存 冻存微生物种时，必须迅速降低温 度，起用时也迅速融化。应尽力避免反复冷冻 与融化。 为减少细菌在冷冻时的死亡，可于菌液内 加入10%左右的甘油、蔗糖或牛奶作为保护剂。 冷冻真空干燥（冻干）法 是保存菌毒种、疫
苗、补体、血清等的良好方法，可保存微生物
及生物制剂数月至数年不失活。
2. 高温
（2）湿热灭菌法
有煮沸灭菌、巴氏消毒、流通蒸汽灭菌、高压
蒸汽灭菌几种。
煮沸灭菌 煮沸10-20min可杀死所有细菌
繁殖体，芽抱常需煮沸1-2h才被杀死。手术器
械、注射器、针头及食具等可用此法。
巴氏消毒法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
德国巴斯德1863年发明，以较低温度杀灭液
态食品中病原菌或特定微生物，尽量保持其营 养成分和风味的消毒方法。主要用于葡萄酒、 啤酒、果酒及牛乳等食品的消毒。
2.阳光 直射日光有强烈杀菌作用，是天然杀菌因 素，紫外线是日光杀菌作用的主要因素。许多微 生物在直射日光下，半小时到数小时即可死亡。 芽抱的抵抗力强，经20h才死亡。 阳光暴晒消毒 在实践中，日光对被污染的土壤、 牧场、畜舍垫料及用具等的消毒均具有重要意义。
⑴光感作用(Photosensitization) 将某些荧光染料如美蓝、伊红、汞溴红、沙 黄等加入培养基中，能增强可见光线的杀菌作用， 这种现象称为光感作用。 ⑵光复活作用(Photoreactivation) 细菌受致死量的紫外线照射后，3h以内若 再用可见光照射，则部分细菌又能恢复其活力， 这种现象称为光复活作用；波长为510nm的可见 光对细菌的光复活作用最有效。
高温对微生物具有致死作用，常用于消毒和灭菌。
高温对使菌体蛋白质变性或凝固，酶失去活性，
导致细菌死亡。
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物理因素对细菌的影响
温度、光线、干燥、超声波、过滤等因素均可影响细菌的新陈代谢及其化学组成，故常选用一些物理方法达到消毒和灭菌的目的。
（一）温度
各种细菌都需在最适生长温度的范围内生长。
当外界温度明显高于最适生长温度，细菌被杀死；如果在低于细菌的最低生长温度时，细菌代谢活动受抑制，则出现抑菌作用。
1.高温：细菌蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍导致细菌死亡。
大多数无芽胞细菌55℃～60℃加热30～60min即被杀死；加热100℃立即死亡，有芽胞的破伤风芽胞梭菌需煮沸3h才被杀死。
热力灭菌分湿热和干热两种。
在同一温度下，前者的效力大于后者。
（1）湿热：常用的方法有
1）巴氏消毒法：方法有两种：一是61.1℃～62.8℃30min；另一是
71.7℃l5～30s，目前主要用于牛乳消毒。
2）煮沸法：煮沸l00℃（1个大气压状态下）。
5min中可杀死细菌繁殖体，如于水中加入2％碳酸钠，则可提高其沸点至105℃，既杀死芽胞，又防止金属器皿生锈。
3）流通蒸气灭菌法：常用阿诺（Arnold）流通蒸气灭菌器或蒸笼。
利用一个大气压下l00℃水蒸气进行消毒。
经10～30min细菌繁殖体被杀死，但对芽胞的作用不大。
4）间歇灭菌法：采用间歇加热方式达到灭菌目的。
方法是将待灭菌物品置于Arnold灭菌器内，经l00℃加热15～30min，每日一次，连续3次。
每次灭菌后，取出再置37℃孵箱过夜，使残存的芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸气加热使之被杀死。
这样可达到杀死芽胞又使不耐100℃的物质保存下来。
5）加压蒸汽灭菌法：利用密闭的耐高压的高压蒸汽灭菌器，在蒸汽不外溢的条件下，使锅内压力增高，蒸汽的温度也随之增高，大大加强其杀菌效力。
通常在103.4kPa的压力下达
121.3℃，维持15～20min可杀灭所有细菌芽胞和繁殖体。
本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。
（2）干热
1）烧灼：是常用的干热灭菌法。
微生物实验室使用的接种环、接种针、瓶口和试管口常在火焰上烧灼灭菌。
2）干烤：在密闭干烤箱内加温至160℃～170℃维持2h是对一般玻璃器皿、注射器、瓷器的灭菌方法，适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品。
2.低温：一般细菌耐低温，在低温条件下，细菌代谢活动降低不再繁殖，能较长时间维持生命，故常用于保存菌种。
为避免解冻时对细菌的损伤，可在低温状态下真空抽干，去尽水分，此法称冷冻真空干燥法，可保存细菌数年至数十年，是目前保存菌种的方法。
（二）光线和射线
随光线和射线的波长、强度、作用距离、持续时间而影响它们对细菌的作用。
1.日光和紫外线：发挥杀菌作用的日光主要是紫外线，波长265～266nm时杀菌作用。
这是由于紫外线使DNA分子形成胸腺嘧啶双聚体，干扰DNA正常复制，导致细菌死亡。
此外紫外线可使分子氧变成臭氧，后者具有杀菌能力。
杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼角膜等均有损伤作用，使用时应注意防护。
人工紫外线用低压水银蒸气灯产生，照射的能量以单位时间内每平方厘米的微瓦数（μw）计算。
一支15W的紫外灯在lm内传递38μw.s／cm2射线。
无芽胞菌一般的致死量为1800～6500μw.s／cm2，杀死芽胞则需该剂量的l0倍。
2.电离辐射：微生物体中的水受电离照射后产生的自由基及自由基离子破坏微生物核酸、酶和蛋白质致微生物死亡，适用于不耐热物品的灭菌。
如X线、γ射线、高速电子等。
（三）超声与超声波
不被人耳感受的高于20千周／秒的声波称超声波。
杀菌机制是超声波通过液体时发生的空腔化作用破坏了原生质的胶体状态，导致细菌死亡。
一般用于细胞的粉碎以提取细胞组分和抗原制备。
（四）滤过除菌
滤过是以物理阻留方法将液体或空气中的微生物除去。
所用的器具为滤器。
滤器中的微孔只允许液体或气体中小于滤孔孔径的物质通过。
滤器中的复层网状微孔结构通过毛细管阻留、筛孔阻留和静电吸附综合作用达到除菌效能。
滤器的种类很多，目前常用的有薄膜滤器。
用于除菌的滤膜孔径为0.22μm.另外以石棉板为滤板的金属滤器称Seitz滤器（蔡氏滤器），按其滤孔大小分成三种：K型滤孔，澄清用；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过；EK滤孔居中，用以去除一般细菌。
全由玻璃制成的玻璃滤器分成G1～G6六种。
G5、G6两型能阻止细菌通过。
（五）干燥
许多细菌的繁殖体在空气中干燥时可以死亡。
干燥引起细菌脱水、蛋白质变性和盐类浓缩，因而妨碍细菌的代谢、生长、繁殖而引起细菌死亡。
各种细菌对干燥的抵抗力不同，肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌较小；链球菌、葡萄球菌与结核杆菌等较大；芽孢抵抗力。
含于飞沫或痰液中的细菌，因受有机物的保护，可以抵抗干燥，此与呼吸道感染的传布有关。
食物经晒干、烘干、风干等干燥后，水分减少，不适于细菌等繁殖，因而可延长食物的保存时间，起到防腐作用。