分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告
分⼦⽣物学实验设计报告分⼦⽣物学实验设计报告——得到表达绿⾊荧光蛋⽩基因的⼤肠杆菌郭晓涵艾珉吉实验最终⽬标：得到表达绿⾊荧光蛋⽩基因的⼤肠杆菌实验所需质粒：PET28a质粒、pEGFP-N3质粒（⽼师提供）（pEGFP-N3载体为真核细胞表达载体）实验所需细胞：DH-5α和BL-21感受态细胞（⽼师提供）实验主要部分：将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转⼊感受态细胞并扩⼤培养；提取上述两种质粒并酶切检测；扩增EGPF基因⽚段和pET-28a酶切质粒并构建重组质粒；重组质粒转⼊DH-5α扩增及菌落PCR检测与细胞发光检测。
图⽰如下：两种质粒扩⼤培养及酶切检测载体质粒PET-28a ⽬的基因质粒(绿⾊荧光蛋⽩)质粒重组具体步骤：分离质粒DNA的⽅法⼀般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒DNA重组质粒PET-28a-GFP的构建：E.coli DH-5α（pEGFP-N3） E.coli DH-5α（pET-28a）质粒pEGFP-N3 质粒pET-28a插⼊⽚段连接插⼊⽚段重组质粒（PET-28a-GFP）⼀、将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转⼊DH-5α感受态细胞并扩⼤培养1. 取200 µl制备好的感受态细胞，冰上解冻，均匀悬浮。
2. 分别加⼊2 µl⽬的质粒，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
3. 42 ℃⽔浴2min后，冰上放置2 min。
4. 加⼊400µl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
5. 取200 µl悬浮细胞均匀涂布在LB固体培养基（含卡那霉素）上，培养⽫正放静置1-2 h后，封⼝膜封好，37 ℃倒置培养12-18 h，留做备⽤。
注：LB培养液的制备⽅法——胰蛋⽩胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，⽤1N NaOH调pH 7.5。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告
实验目的：
通过本次实验，我们旨在探究DNA复制、基因表达和蛋白质合成等分子生物学的基本原理，加深对分子水平生物学过程的理解，培养实验操作技能和科学思维能力。
实验材料与方法：
1. 实验材料：大肠杆菌（E. coli）细菌菌斑、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、琼脂糖电泳试剂、PCR扩增仪、电泳仪等。
2. 实验步骤：
a. DNA提取：取一支含E. coli细菌菌斑的移液管，用DNA提取试剂盒提取DNA。
b. PCR扩增：将提取的DNA加入PCR试剂盒中进行PCR扩增反应。
c. 原核表达：将扩增后的DNA片段转入大肠杆菌进行原核表达。
d. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品加入琼脂糖凝胶，通过电泳进行蛋白质分子量的分离。
实验结果与分析：
1. DNA提取：成功提取到E. coli细菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳观察到DNA的带型。
2. PCR扩增：成功扩增出目标DNA片段，并经过验证测序结果正确。
3. 原核表达：大肠杆菌成功表达了目标蛋白质，通过SDS-PAGE电泳观察到目标蛋白质的条带。
4. SDS-PAGE电泳：观察到蛋白质的分子量差异，验证了蛋白质的分离效果。
结论与讨论：
通过本次实验，我们成功实现了DNA提取、PCR扩增、原核表达和蛋白质分离等分子生物学实验步骤，从而全面了解了分子生物学过程的基本原理。
实验结果表明，实验操作规范，结果可靠，为今后的科研工作和实验基础奠定了坚实的基础。
同时，也发现了实验中的一些不足之处，提出了改进的建议，为进一步的研究工作提供了参考。
参考文献：
无。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告分子生物学实验报告引言分子生物学是一门研究生物大分子结构、功能和相互作用的学科，通过实验手段揭示生命现象的分子机理。
本实验旨在探究DNA复制过程中的关键步骤，以及RNA转录和蛋白质翻译的基本原理。
实验一：DNA复制DNA复制是细胞分裂过程中必不可少的步骤，它保证了遗传信息的传递和维持。
本实验通过模拟DNA复制过程，研究DNA复制酶的作用和复制的准确性。
材料：- DNA模板- DNA聚合酶- 引物- dNTPs- 缓冲液方法：1. 准备反应体系，包括DNA模板、DNA聚合酶、引物、dNTPs和缓冲液。
2. 在适当的温度下，将反应体系放入PCR仪中进行反应。
3. 取样并进行凝胶电泳分析，观察DNA复制产物。
结果：通过凝胶电泳分析，我们观察到DNA复制产物的出现。
这表明DNA聚合酶能够在模板DNA上合成新的DNA链，并且复制的过程较为准确。
讨论：DNA复制的准确性是生命传递遗传信息的基础。
DNA聚合酶具有校正功能，能够识别和修复错误的碱基配对。
这种精确性保证了基因组的稳定性和可靠性。
实验二：RNA转录RNA转录是将DNA信息转录成RNA的过程，它是基因表达的第一步。
本实验旨在研究RNA转录的机制和调控。
材料：- DNA模板- RNA聚合酶- 引物- NTPs- 缓冲液方法：1. 准备反应体系，包括DNA模板、RNA聚合酶、引物、NTPs和缓冲液。
2. 在适当的温度下，将反应体系放入PCR仪中进行反应。
3. 取样并进行凝胶电泳分析，观察转录产物。
结果：凝胶电泳分析显示出RNA转录产物的出现。
这表明RNA聚合酶能够在DNA模板上合成RNA链。
讨论：RNA转录是基因表达的第一步，它决定了细胞内特定基因的表达水平。
RNA聚合酶通过与DNA模板的互作用，选择性地合成特定的RNA链。
这种选择性转录是基因调控的关键。
实验三：蛋白质翻译蛋白质翻译是将RNA信息翻译成蛋白质的过程，它是生物体内蛋白质合成的关键步骤。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。
（2）了解引物设计的基本要求。
1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。
pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。
pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。
经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。
因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。
pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。
分子生物学实训报告
一、实训背景分子生物学是研究生物大分子如蛋白质、核酸的结构与功能的一门学科。
随着生命科学技术的不断发展，分子生物学在医学、农业、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。
为了更好地理解和掌握分子生物学的基本理论和技术，我们开展了为期两周的分子生物学实训课程。
本次实训旨在通过实际操作，加深对分子生物学理论知识的理解，提高实验技能，培养科研素养。
二、实训目的1. 熟悉分子生物学实验室的基本操作规程和安全规范。
2. 掌握DNA提取、PCR扩增、酶切、电泳等分子生物学实验技术。
3. 理解基因克隆、基因表达、蛋白质分析等分子生物学实验原理。
4. 提高团队协作和沟通能力，培养科研素养。
三、实训内容1. 实验室基本操作与安全规范（1）熟悉实验室布局，了解各种仪器的使用方法。
（2）学习实验室安全操作规程，掌握实验室废弃物处理方法。
（3）进行实验前的准备工作，如配制试剂、消毒、无菌操作等。
2. DNA提取（1）了解DNA提取的原理和常用方法。
（2）学习酚-氯仿法提取DNA。
（3）对提取的DNA进行质量检测，如A260/A280比值、琼脂糖凝胶电泳等。
3. PCR扩增（1）了解PCR扩增的原理和步骤。
（2）设计PCR引物，进行PCR反应。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 酶切（1）了解酶切原理和酶切反应条件。
（2）学习限制性内切酶的用法。
（3）进行酶切反应，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 电泳（1）了解电泳原理和电泳技术。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等电泳技术。
（3）对DNA、蛋白质等生物大分子进行电泳分离和检测。
6. 基因克隆、基因表达、蛋白质分析（1）了解基因克隆、基因表达、蛋白质分析的基本原理。
（2）学习相关实验技术，如载体构建、重组表达、蛋白纯化等。
（3）对克隆的基因、表达的蛋白进行检测和分析。
四、实训过程1. 实验前准备（1）查阅相关文献，了解实验原理和操作步骤。
（2）配制实验试剂，确保实验用品齐全。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告实验目的：探究基因在DNA复制过程中的作用及其表达机制。
实验材料与方法：材料：1. DNA模板：提取自大肠杆菌细胞中的质粒DNA。
2. DNA聚合酶：用于合成新的DNA链。
3. 引物：用于DNA聚合酶的引导和定向合成DNA。
4. dNTPs：脱氧核苷酸三磷酸盐，提供新的核苷酸单位供DNA聚合酶使用。
方法：1. DNA复制反应：将DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs混合在一起，加入适量缓冲液和镁离子，并在适温条件下进行DNA复制反应。
2. DNA扩增：通过PCR技术，利用引物的特异性，从DNA模板中扩增目标序列。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于分离和检测PCR产物，通过电泳迁移率差异判断扩增产物的大小。
实验结果：1. DNA复制反应成功进行，获得了新的DNA链。
2. PCR反应成功扩增目标序列，观察到明显的放大带。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示PCR产物的大小符合预期。
实验分析与讨论：本实验通过模拟DNA的复制过程，成功合成了新的DNA链，并通过PCR技术扩增了目标序列。
这一结果验证了基因在DNA复制过程中的作用。
在DNA复制过程中，DNA聚合酶是关键的酶类。
DNA聚合酶能够识别DNA的模板链，并根据模板链的信息合成新的互补链。
在实验中，添加了引物和dNTPs，引物可以定向和引导DNA聚合酶的合成，dNTPs则提供了能量和碱基单位，支持DNA聚合酶的复制活动。
PCR技术是一种重要的生物分子技术，其通过引物的特异性识别和引导，扩增目标序列。
实验中，选择了适当的引物序列，使其能够与目标序列特异性地结合，并保证扩增反应的特异性和选择性。
PCR反应可以在短时间内扩增大量的目标DNA序列，为后续的分析和研究提供了足够的样品。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的分析方法，通过电场驱动DNA分子在凝胶中迁移，根据分子大小的差异来判断扩增产物的大小。
在实验中，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示出明显的PCR产物带，与预期的目标序列大小相符，说明PCR扩增反应成功，目标序列得到了扩增。
分子生物学实验报告
分⼦⽣物学实验报告PCR基因扩增实验⽬的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)，是⼀种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的⽅法，故⼜称为基因的体外扩增法。
在待扩增的DNA⽚断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退⽕和延伸若⼲个循环后，DNA扩增2的n 次⽅倍。
实验仪器：基因扩增仪移液器实验试剂：10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4种dNTPTaq酶DNA模板两种引物（正向引物和反向引物）实验步骤:`1、按顺序向微量离⼼管中依次加⼊：ddH2O 20µlDNA 样品5µl10×PCR 缓冲液5µldNTP 4µl引物I 5µl引物Ⅱ5µl混匀。
2、PCR反应参数(1) 94℃变性2min(2) 94℃变性30sec，(3) 66℃退⽕30sec，(4) 72 ℃延伸1min。
(5) 重复(2)-(4)40次（6）72 ℃延伸7min。
（7）4℃保存3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10µl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。
保持电流40mA。
电泳结束后，⽤EB染⾊15min，紫外灯下观察结果。
实验结果：照⽚结果图1 2 3 41.10ul样品2.样品3.DNA相对分⼦质量标准4.对照DNA琼脂糖凝胶电泳实验⽬的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的⽅法和技术。
实验原理：DNA分⼦在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作⽤下朝正极移动。
在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有⼀定孔径，长度不同的DNA分⼦由于所受凝胶的阻遏作⽤⼤⼩不⼀，迁移的速度不同，从⽽可以按照分⼦量⼤⼩得到有效分离。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应，即分⼦本⾝的⼤⼩和构型。
分子生物学检验实习报告
实习报告一、实习背景及目的随着生物科学和医学技术的快速发展，分子生物学检验在疾病诊断、治疗和科研等领域发挥着越来越重要的作用。
本次实习旨在通过在分子生物学检验实验室的实际操作，掌握分子生物学检验的基本原理、技术方法和实验操作，提高自己的实验能力和专业素养。
二、实习内容及过程1. 实验室基本原理及操作学习在实习初期，我在导师的指导下，学习了分子生物学检验实验室的基本原理和操作方法，包括实验室的安全操作规范、实验仪器的使用和维护、实验试剂的配制和保存等。
同时，我还学习了实验室常用的分子生物学技术，如PCR、DNA提取、电泳、基因克隆等。
2. 实际操作及实验项目在基本原理和操作学习的基础上，我开始参与实验室的实际操作和实验项目。
我参与了一系列分子生物学检验实验，如基因突变检测、基因表达定量分析、病原体检测等。
在实验过程中，我严格遵循实验操作规程，确保实验数据的准确性和可靠性。
3. 实验数据分析和报告撰写实验完成后，我对实验数据进行了分析和处理，并根据实验结果撰写了实验报告。
在报告撰写过程中，我充分展示了实验设计、实验操作和实验结果的分析，并对实验中遇到的问题进行了总结和反思。
三、实习收获及反思1. 实习收获通过本次实习，我掌握了分子生物学检验的基本原理、技术方法和实验操作，提高了自己的实验能力和专业素养。
同时，我也学会了如何分析和处理实验数据，提高了自己的科研能力。
2. 实习反思在实习过程中，我认识到理论知识与实际操作的重要性。
只有扎实的理论基础和丰富的实际操作经验，才能在实验过程中得心应手，确保实验的顺利进行。
此外，我也意识到团队合作和沟通在实验过程中的重要性。
在以后的学习和工作中，我将更加注重团队合作和沟通能力的培养。
四、实习总结本次分子生物学检验实习让我受益匪浅，不仅提高了自己的实验能力和专业素养，也让我对分子生物学检验有了更深的理解和认识。
在今后的学习和工作中，我将继续努力，不断提高自己的综合素质，为医学事业的发展贡献自己的力量。
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分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达一、引言荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。
它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。
通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。
目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。
这两种方法费时费力，过程繁冗。
而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。
突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
<菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省时，快捷，但容易出现假阳性。
为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。
三、实验步骤1.质粒DNA的提取实验原理：~质粒：一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制能力，，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，包括抗生素、修饰酶等。
载体：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。
目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
碱变性法抽提质粒DNA：基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。
在实验时，我们先分散细胞，通过螯合金属离子使酶失活，并防止DNA的降解。
随后细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，在酸性条件下质粒DNA复性，同时留在上清液中。
而大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
由此达到分离的效果实验目的：掌握碱法抽提质粒DNA的原理和方法。
实验材料：材料：含pET- 28a质粒的大肠杆菌，含pEGFP-N3质粒的大肠杆菌试剂：@1）溶液Ⅰ50 mL, 葡萄糖, 50 mmol/L , 25 mmol/L Tris-HCl (pH , 10 mmol/L EDTA (pH , 用前加溶菌酶4mg/℃高压灭菌15 min后置于0~4℃贮存；2）溶液Ⅱ100 mL, mol/L NaOH ,SDS, 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；3）溶液Ⅲ100 mL, 60 mL KOAc (5 mol/L), mL冰乙酸, mL H2O .该溶液钾离子浓度为3 mol/L, 醋酸根离子浓度为5mol/L；4）酚-氯仿(1:1,V:V)；5）TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl , 1mmol/LEDTA , 其中RNAase20ug/mL.6）70%乙醇，无水乙醇；7）液体LB培养基（）, 10 g/L胰蛋白胨, 5 g/L酵母提取物, 10 g/L NaCl , 1 mL/L NaOH(1 mol/L)；>8）氨苄青霉素25mg/mL贮备液仪器设备：恒温水浴锅，高压灭菌锅，超净工作台，移液器，高速离心机，制冰机，漩涡振荡器实验方法：1 将含pET- 28a质粒的大肠杆菌，含pEGFP-N3质粒的大肠杆菌分别接种在液体培养基中（加卡那霉素50μg/mL），37℃培养过夜。
2 取培养菌液置Eppendorf小管中，10000rpm离心2min，弃上清液。
3 加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。
4 加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。
5 加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。
&6 10000rpm离心5 min，取上清液于另一干净的离心管中。
7 向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm 离心10 min，将上清液转移至新的离心管中。
8 加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中。
9 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置1h。
10 12000rpm 离心5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
11 加800μL70%乙醇，12000rpm离心1 min，倒尽上清液，室温自然干燥30min。
2.琼脂糖凝胶电泳与胶回收提纯所提DNA*实验原理电泳：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。
但有时也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。
其结构单元是d-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖。
许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。
影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小。
分子越大，迁移的越慢，摩擦阻力越大，大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。
（2）琼脂糖浓度。
（3）DNA的构象。
（4）所用的电压。
低电压时，DN**段迁移率与所用的电压成正比。
电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。
要获得大于2kb DN**段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。
（5）电泳缓冲。
缺乏离子则电导率降低，DNA 或者不动或者迁移很慢。
高离子强度时DNA变性可能会因为产热变性。
实验目的：检验是否获得所需的质粒实验材料：材料和仪器电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，微波炉，水平仪，10、100、1000μL微量取液器各一支，凝胶成像系统，提取的pET- 28a和pEGFP-N3质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。
试剂：Gold view（DNA染料）；×TBE缓冲液：Tris 、硼酸、EDTA·Na2·2H2O ，定容至200ml，使用时稀释10倍；6×上样缓冲液：溴酚蓝％、蔗糖40%；DNA marker。
!实验方法：琼脂糖凝胶板的制备称取琼脂糖，置于锥形瓶中，加入×TBE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，排除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。
静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。
加样胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入×TBE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL6×上样缓冲液混匀，加入胶板的样品小槽内。
电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。
{观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
用胶回收试剂盒回收质粒3.PCR扩增EGFP和PET-28a（适应于无缝克隆的特殊引物）并进行质粒重组实验原理无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服传统方法费时费力，过程繁冗的缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。
突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增，与常规PCR法是相同的。
唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。
在没有dNTP存在的情况下用T4 DNA聚合酶中的3’5’外切酶活性22℃处理，产生含有同源序列的5’端突起．突出端的长度可以通过控制3’5’外切酶活性的作用时间来实现，加入dCTP即可终止外切酶活性。
将各片段的酶切产物按等摩尔比混合，在T4 D NA连接缓冲液中于3 7℃完成突出单链的复性重组，形成含有大的缺口的环状中间体．用此中间体转化大肠杆菌，利用大肠杆菌本身的修复作用完成中间体的修复。
而本次实验更是采用无缝克隆法的改进方法，利用混合酶切法提高效率。
同时使用特殊的退火液与退火程序消除在无缝克隆中由于延伸的单链太长而产生的二级结构从而对DNA链的连接造成的影响。
T4 DNA聚合酶在没有dNTP时表现很强的核酸外切酶活性(3’5’)，产生5 ‘ssD NA突出端，单链区的长度可以通过控制反应时间来实现，若同源臂为30bp，则在22℃下处理4 5 min，2 0 bp时则处理3 0 min．待重组的DNA片段以分别单独酶切处理或所有DNA片段等摩尔体积混合再酶切处理。
实验目的：得到pET-28a-GFP重组质粒实验材料：PET-28a质粒，PEGFP-N3质粒，引物，Taq酶，dNTP，buffer，退火缓冲液，实验步骤设计引物根据EGFP基因序列与PET-28a序列再加上前面15-20nt的特异性序列设计出引物。
：PCR利用设计好的引物对EGFG基因序列与PET-28a进行PCR扩增.将引物，模板，taq酶放入PCR仪中.设置反应程序：①94 ℃预变性5min；②94 ℃变性30S；③55 ℃退火30S；④72 ℃延伸60S；\⑤重复步骤②~④30次；⑥72 ℃延伸10min。