电镜实验操作技术
实验三 电子显微镜技术的演示
实验三电子显微镜技术的演示背景知识：普通光学显微镜通过提高和改善透镜的性能，使放大率达到1000~1500倍左右，但一直未超过2000倍。
这是由于普通光学显微镜的放大能力受光的波长的限制。
为了从更高的层次上研究物质的结构，必须另辟蹊径，创造出功能更强的显微镜。
20世纪20年代法国科学家德布罗意发现电子流也具有波动性，其波长与能量有确定关系，能量越大波长越短，比如电子学1000伏特的电场加速后其波长是0.388埃，用10万伏电场加速后波长只有0.0387埃，于是科学家们就想到是否可以用电子束来代替光波，这是电子显微镜即将诞生的一个先兆。
用电子束来制造显微镜，关键是找到能使电子束聚焦的透镜，光学透镜是无法会聚电子束的。
1926年，德国科学家蒲许提出了关于电子在磁场中运动的理论。
他指出：“具有轴对称性的磁场对电子束来说起着透镜的作用。
”这样，蒲许就从理论上解决了电子显微镜的透镜问题，因为电子束来说，磁场显示出透镜的作用，所以称为“磁透镜”。
1931年，德国柏林工科大学的Knoll和Ruska制作成功第一台电子显微镜──它是一台经过改进的阴极射线示波器，成功地得到了铜网的放大像──第一次由电子束形成的图像，加速电压为7万，最初放大率仅为17倍。
尽管分辨率还不如光学显微镜高，但它却证实了使用电子束和电子透镜可形成与光学像相同的电子像。
经过不断地改进，1933年Ruska和Bodo Von Borries又制成了第二台两级短焦距的电子显微镜，获得了金属箔和纤维的放大1万倍的电子图像。
虽然放大率得到提高，但分辨率当时还刚刚达到光学显微镜的水平。
1937年应西门子公司的邀请，Ruska建立了超显微镜学实验室。
1939年西门子公司制造出分辨本领达到30埃的世界上最早的实用电子显微镜，并投入批量生产。
随后，透射电镜的商业产品由美国无线电公司于1941年开始制作生产。
电子显微镜的出现使人类的洞察能力提高了好几百倍，不仅看到了病毒，而且看见了一些大分子，即使经过特殊制备的某些类型材料样品里的原子，也能够被看到。
电子显微镜操作步骤说明书
电子显微镜操作步骤说明书简介：电子显微镜（Electron Microscope，简称EM）是一种利用电子束来观察和研究物质的高分辨率显微技术。
本文将详细介绍电子显微镜的操作步骤，以帮助读者正确操作并获得准确的实验结果。
操作步骤：1. 准备工作在使用电子显微镜之前，需要进行一些准备工作。
首先，确保实验室环境干净，无尘、无污物，以确保获得清晰的显微图像。
其次，将样本制备好，确保样本表面平整、无污染，并且大小适宜，方便放置于电子显微镜观察。
2. 开机与预热将电子显微镜接通电源，确保连接无误。
然后，打开电子显微镜主机的电源开关，待其启动完成后，进行预热。
预热时间根据具体仪器而有所不同，请根据仪器使用说明书确定预热时间。
在预热过程中，可以进行一些其他准备工作，如调整目镜和物镜的位置。
3. 调整仪器参数在预热完成后，进入仪器调整阶段。
首先，调整加速电压和透射电镜电压。
加速电压决定了电子束的能量，透射电镜电压决定了样本投射到屏幕上的亮度和对比度。
根据实验要求，选择合适的加速电压和透射电镜电压。
4. 样本装载将已经准备好的样本装入样本架，并通过样本架的旋转或移动机构将样本调整到适当的位置。
确保样本安装稳固，并注意不要触碰样本的表面。
5. 调整焦距与对焦通过调整物镜的焦距和目镜的焦距，可以实现对样本的清晰观察。
首先，通过移动物镜或调整物镜焦距的方式来对焦。
然后，通过调整目镜的焦距，使样本的图像清晰可见。
在对焦过程中，可以通过透射电镜和屏幕上的图像实时观察和调整。
6. 选择增大倍率与观察根据需要，选择合适的增大倍率。
电子显微镜具有较高的放大倍率，可以观察微小的物体和细节。
在观察过程中，可以通过样本架的调整，以及调节图像亮度和对比度，来获得最佳的观察效果。
7. 实时调整参数与记录结果在观察样本的过程中，可能需要对加速电压、透射电镜电压、焦距等参数进行实时调整，以获得更好的观察效果。
同时，将观察到的结果记录下来，以备后续分析和研究使用。
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤场发射扫描电镜（Field Emission Scanning Electron Microscopy）是一种高分辨率的电子显微镜技术，可用于观察和分析各种材料的表面形貌和微观结构。
为了获得清晰的显微图像，样品制备和操作步骤非常重要。
一、样品制备1. 样品的选择：场发射扫描电镜适用于不同种类的材料，如金属、陶瓷、聚合物等。
选择合适的样品很关键，它应具备研究对象的特性，并且能够承受电子束的辐照。
2. 样品的固定：为了保持样品的形状和结构不变，通常需要将其进行固定。
对于固态材料，可以使用金属夹片或导电胶进行固定。
对于液态材料，可以将其冷冻或凝胶化，以保持其形状。
3. 样品的切割和打磨：有时候，需要将样品切割成适当的尺寸，以便放入样品架中。
这可以通过使用金刚石切割机、电解或机械研磨仪器等设备来完成。
4. 样品的真空处理：在将样品放入场发射扫描电镜前，通常需要将其进行真空处理。
这可以通过将样品放入真空干燥器中、在低压下进行加热或冷冻干燥来完成。
真空处理有助于去除空气中的水分和气体，以减小背景干扰。
二、操作步骤1. 打开电镜系统：在开始操作前，需要将场发射扫描电镜系统打开并进行预热。
预热时间通常需要几十分钟，以保证系统内部达到稳定的工作温度。
2. 放置样品：将样品放置在样品架上，并确保其良好接触。
对于粉末状样品，可以使用导电胶将其固定在样品支架上。
对于固态样品，可以使用金属夹片固定在样品架上。
3. 调整显微镜参数：通过调整电子束能量、聚焦、工作距离等参数，来优化扫描电子显微镜的成像质量。
这些参数的选择取决于样品的特性和所需的分辨率。
4. 开始观察：一切准备就绪后，可以开始观察样品。
通过控制电子束的扫描和探测系统，可以获得样品的表面形貌和微观结构的信息。
在观察过程中，要注意避免样品表面的污染和损坏。
5. 数据分析：场发射扫描电镜获得的图像可以进一步进行数据分析。
可以通过对图像进行增强、测量尺寸和形状、进行结构分析等手段，来得到更详细的样品信息。
sem的实验方法
sem的实验方法
SEM（扫描电子显微镜）是一种常用的显微镜技术，用于观察和分析样品的表面形貌和微观结构。
下面是SEM实验的基本方法：
1. 样品制备：根据需要观察的物体或材料，选择合适的样品制备方法。
常见的方法包括金属蒸发覆盖、碳薄膜覆盖、冷冻断裂、超声清洗等。
2. 样品固定：将样品固定在SEM的样品台上。
通常可以使用导电胶或双面导电胶带将样品固定在样品台上，并确保样品与样品台之间有良好的电导性。
3. 真空处理：将样品放入SEM的真空室中，并进行真空处理，以确保在SEM观察过程中减少气体干扰。
4. 调节参数：在开始观察之前，需要根据样品的性质和要观察的目标，设置适当的加速电压、束流亮度、探针电流等参数。
5. 扫描观察：调整SEM的对焦和扫描参数，使电子束在样品表面扫描。
观察过程中可以通过调整探针电流和探针尺寸来获得所需的表面细节。
6. 图像获取：使用SEM中的二次电子或反射电子检测器，捕捉样品表面反射出的电子信号，并将其转换成图像。
可以通过调整对比度、亮度等参数来优化图像质量。
7. 数据分析：对获得的SEM图像进行分析和解读，可以使用图像处理软件进行形貌特征、颗粒分布、晶体结构等的测量和分析。
需要注意的是，SEM操作需要在专门的实验室环境下进行，并且
需要遵循安全操作规程，以确保操作人员和设备的安全。
此外，不同样品的性质和要求可能需要不同的处理方法和参数设置，因此在实验前应充分了解样品的特性和研究目标，以便选择合适的实验方法。
冷冻电镜实验方法
冷冻电镜实验方法引言：冷冻电镜（Cryo-EM）是一种先进的显微镜技术，可以用于观察生物分子的高分辨率结构。
与传统的电镜技术相比，冷冻电镜在样品制备过程中避免了化学固化和染色等步骤，因此能够保持生物分子的原始状态，提供更真实的结构信息。
本文将介绍冷冻电镜实验方法的基本步骤和关键技术。
一、样品制备1. 选择合适的样品：冷冻电镜适用于观察各种生物分子的结构，包括蛋白质、核酸、病毒等。
样品应具有较高的纯度和稳定性，以确保实验结果的准确性。
2. 冷冻固化：将样品溶液滴在金属网格上，然后迅速将其浸入液氮中，使样品迅速冷冻成无定形的冰层。
冷冻过程中，要尽量避免样品的晶化和结构变化。
3. 选择合适的冷冻介质：冷冻介质可以增强样品的稳定性并减少冷冻过程中的结构损伤。
常用的冷冻介质包括蔗糖、甘油等。
二、冷冻电镜图像获取1. 冷冻电镜仪器设置：调整冷冻电镜的操作参数，如加速电压、聚焦、对比度等，以获得清晰的图像。
2. 样品加载：将冷冻固化的样品网格安装到冷冻电镜仪器中，确保样品的位置准确，并避免震动和晶格偏移。
3. 图像获取：通过调整电子束的强度和聚焦，使电子束通过样品并与样品相互作用，产生散射。
通过捕捉和记录散射电子的位置和强度，得到样品的二维或三维图像。
4. 图像处理：对获得的图像进行去噪、对齐、投影重建等处理，以提高图像的质量和分辨率。
三、冷冻电镜实验注意事项1. 样品保持低温：在整个实验过程中，要保持样品的低温状态，以防止样品结构的热损伤和冰晶的熔化。
2. 避免辐射损伤：电子束的辐射可能会对样品产生破坏，因此在图像获取过程中要控制电子束的强度和曝光时间。
3. 样品纯度和稳定性：样品的纯度和稳定性对于获得高质量的冷冻电镜图像至关重要。
应该避免样品中的杂质和聚集现象。
结论：冷冻电镜实验方法是一种强大的工具，可以帮助科学家们研究生物分子的结构和功能。
通过合理的样品制备和仪器调整，冷冻电镜可以提供高分辨率和真实的结构信息，为生物科学研究提供有力的支持。
免疫电镜实验步骤
免疫电镜实验步骤免疫电镜（immuno-electron microscopy，IEM）是一种结合了免疫学和电镜技术的方法，能够直接在细胞或组织水平上观察和定位特定抗原。
它是一种有力的工具，可以帮助研究人员研究细胞和组织中的蛋白质相互作用，了解其在亚细胞水平的功能和定位。
免疫电镜实验步骤如下：1. 细胞或组织固定：首先，需要处理样品以使其具有电镜处理所需的高度稳定性。
通常，细胞或组织样本会使用交联剂如戊二醛进行固定。
固定的目的是保持样本的形态和结构，并防止其在后续处理过程中发生破坏。
2. 裁剪：将固定的细胞或组织样品切成适当的尺寸和形状以适应电镜的观察要求。
这通常需要非常小的块，以便于后续处理。
3. 过渡液处理：将样品经过一系列的过渡液处理，以去除残留的固定剂和使样品适应后续处理步骤。
这些过渡液通常是缓冲液，比如磷酸盐缓冲液。
4. 与抗原特异性的抗体结合：将样品与抗原特异性的抗体结合，以实现对特定抗原的检测。
这一步骤是免疫电镜实验的核心。
抗体可以直接标记电镜可见的标记物，如金颗粒，或作为未标记抗体来标记后续参与复合物的二级抗体。
5. 渗透处理：对样品进行渗透处理，旨在增强电镜对样品的可见度。
渗透剂的选择基于具体的研究问题，可以使用醋酸铀、酸酮铀等物质。
6. 样品固化：使用适当的聚合剂，如聚合酮树脂，对样品进行固化，以使其能够保持其形态和结构，并便于切片后的后续处理。
7. 切片：将固化的样品切成极薄的切片，通常在50-100 nm的范围内。
切片过程通常通过使用超微切片机或超声刀来完成。
8. 样品染色：对切片的样品进行染色以增强对抗原的可见度。
可以使用核苷酸染料如乌尔红，或金标记等染色剂。
9. 电镜观察：将样品放置在电子显微镜中，并使用适当的电压和放大倍数进行观察和记录。
通过观察电镜图像，可以获得关于抗原的位置、分布和亚细胞定位的信息。
总结：免疫电镜实验是一种强大的技术，可以帮助研究人员观察和定位特定抗原。
细胞电镜步骤
细胞电镜步骤一、引言细胞电镜（electron microscopy）是一种利用电子束代替光束进行显微观察的技术。
相比传统的光学显微镜，细胞电镜具有更高的分辨率和放大倍率，能够观察到更细微的细胞结构，为细胞学研究提供了重要的工具。
本文将介绍细胞电镜的主要步骤。
二、样品制备1. 固定要观察细胞的内部结构，首先需要将细胞固定在样品上。
常用的固定剂包括戊二醛、冰醋酸、乙醛等。
固定剂可以杀死细胞并保持其形态和结构。
2. 切片将固定的细胞组织进行切片，常用的切片工具有超薄切片机、刮刀等。
切片的厚度通常在50-100纳米之间。
3. 上膜将切片转移到铜或金网膜上，以便在电镜中观察。
上膜时需要小心操作，避免切片的损坏。
三、脱水和浸渍1. 脱水为了观察细胞的内部结构，需要将样品中的水分逐渐去除。
通常会使用一系列浓度递增的乙醇溶液进行脱水处理。
2. 浸渍脱水后，为了使样品能够在电镜中导电，并增加样品的稳定性，需要进行浸渍处理。
常用的浸渍剂有丙酮、环氧树脂等。
四、显微观察1. 扫描电镜（SEM）扫描电镜主要用于观察样品表面的形态结构。
在扫描电镜中，电子束通过扫描样品表面，与样品反射的二次电子或反射电子相互作用，形成图像。
通过调整电子束的扫描方式和参数，可以获得不同放大倍率和清晰度的图像。
2. 透射电镜（TEM）透射电镜主要用于观察样品的内部结构。
在透射电镜中，电子束穿过样品，与样品内部的结构相互作用，形成投影图像。
通过调整电子束的聚焦和对比度，可以获得高分辨率的细胞内部结构图像。
五、图像处理和分析1. 图像获取使用电镜观察样品后，需要将观察到的图像记录下来。
可以使用相机或数字图像采集系统将图像转换为数字信号，保存在计算机中。
2. 图像处理对于采集到的图像，可以使用图像处理软件进行处理和增强。
常见的处理方法包括去噪、增加对比度、调整亮度等。
3. 图像分析通过对处理后的图像进行分析，可以获取细胞内部结构的定量信息。
常见的分析方法包括测量细胞器的大小、计算细胞器的分布密度等。
扫描电镜操作注意事项
扫描电镜操作注意事项扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种利用电子束显微镜技术对样品进行观察和分析的仪器。
它能够提供高分辨率的图像，揭示物质的微观结构和表面形貌。
在进行扫描电镜操作时，需要注意以下几个方面。
一、样品准备在进行扫描电镜操作之前，首先需要对样品进行准备。
样品应该具备一定的导电性，可以通过涂覆导电材料或金属蒸镀的方式来增加导电性。
同时，样品的表面应该光滑、干燥，并且尽量避免灰尘和杂质的污染。
二、仪器设置在使用扫描电镜之前，需要对仪器进行一系列的设置。
首先是选择合适的电子束加速电压和电流，以及扫描速度和扫描模式。
这些参数的选择应该根据样品的特性和需要观察的目标来确定。
同时，还需要调整样品与电子枪之间的距离和角度，以获得清晰的图像。
三、操作技巧在进行扫描电镜操作时，需要掌握一些操作技巧。
首先是对样品进行定位和对焦，确保样品位于电子束的焦点位置，并且图像清晰可见。
其次是控制扫描速度和图像放大倍数，以获得所需的分辨率和细节。
同时，还需要注意避免样品的漂移和电荷积累，可以通过调整扫描参数和样品的位置来解决。
四、图像处理与分析在获得扫描电镜图像后，可以进行一些图像处理和分析。
常用的图像处理方法包括对比度调整、边缘增强和噪声去除等。
同时，还可以利用图像分析软件对图像进行测量和粒径分布分析等操作。
这些操作可以帮助研究人员更好地理解样品的微观结构和特性。
五、安全注意事项在进行扫描电镜操作时，需要注意安全问题。
首先是要避免直接接触电子束，以免对人体造成伤害。
其次是要注意样品的处理和清洁，避免对环境和人体造成污染。
同时，还需要注意仪器的正常运行和维护，及时清洁和更换零部件，以确保仪器的稳定性和可靠性。
扫描电镜操作是一项复杂而精细的工作。
在进行操作时，需要注意样品准备、仪器设置、操作技巧、图像处理与分析以及安全注意事项等方面。
只有掌握了这些注意事项，才能够获得高质量的扫描电镜图像，并且准确地观察和分析样品的微观结构和表面形貌。
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1.2 粉末样品的制备
粉末试样：标准化验用玻片→ 清洗 置微量粉末于一玻片 上 →滴上一滴1％～0.3％的火棉胶→ 醋酸正戊酯溶液 →于上再盖一片玻片→ 使两玻片反复压磨→ 最后迅 速拖离开并在电炉上烤干→ 喷C →划3×3mm2的方格 →浸入蒸馏水中脱膜→ 标准铜网捞膜→ 干燥后备用
TEM的常规操作
2.1调机：总电源ON →稳压器ON→ 循环水开关ON→ 抽真 空： ～20分钟，由真空指示灯确定 面板电源ON→ 复位 →高压（每加一级之前必须先按一下“预备”按钮）→ 过负荷加压处理→ 灯丝电流（缓慢地加到饱和值）→ 调节偏压电阻Bas以使束流值＜20微安（由高压表上指 针转动的格数可知：以未加束流时高压表位置为0，之 后每转一小格束流为10微安）→ 照明系统对中： 5000×→ 调出最小光斑→ 减弱灯丝电流（极慢减弱） 直至出现欠饱和灯丝像→ 调节TilT旋钮使欠饱和灯丝像 成对称形→ 调节Horizontal旋钮是灯丝移至屏中心
成像系统对中：加入试样→ 调出30000×的明场像 →选 定一标志点并移至屏中心 →按亮“HV”按钮（电压中 心法对中按钮）→ 观察标志点的运动：通过调节 Beam Tilt旋钮直至标志点不动为止→ 按一下HV使其 灯熄 → 物镜消像散：加上10倍放大镜 → 在3万～4万倍的视场中 找一个0 ～2mm ×10(在放大镜下观察）的孔洞 →C2.L强散焦→ O.L过焦（调节focus按钮）直至孔洞 边沿出现一条平行于洞边的黑条纹 →细调focus使黑 条纹变到最窄，仔细观察条纹宽度是否均匀，若否， 则调节消像散旋钮直至均匀为止。
CB
A
O.L
从c’点发出的任何电子波,因为 必须聚焦在c点(像) 所以不能通过SAA孔从而保证 了全部衍射谱均来自于AB选区.
A’
B’
C’
SAA平面,I.L物面,O.L的像面 都同在A’B’平面上.
1选区成像
B
a
c b d
A
2 0 1
试样 物镜 I,L物面的 三种位置
SAA与AB共轭
I.L的物面处在0位置屏上衍射斑变小，亮，也锐 1 2
2.2选区衍射像观察
试样→调出明场相 →将合适的选区调至屏中央→ 旋进适 当的（2#）选区光栏 →微调中间镜电流使选区光栏 （I.L的“物”聚焦 →微调物镜电流（focus) 使选区聚 焦，上述两个聚焦操作目的为：使试样（C.L物面）与 SAA平面共轭，为达此目的必须使O.L的像面、选区光 栏平面、中间镜物面①三者重合，以确保衍射花样与选 区物相的严格对应性。否则将可能有部分或大部分衍射 斑束来自选区以外的物相→ ②减弱I.L电流以使I.L物面 上升至O.L的下焦面上以便在屏上出现SEDP→ ③微调 I.L电流以使I.L物面与O.L下焦面严格重合，而衍射斑 变到最小→ ④微调第二聚光镜电流→ ⑤以减小照明孔 径角γ以使衍射斑尺寸进一步减小。
•
0]* O1*
[200]* [200]* O* O2*
a2 a1 a a2
当a=0时，[200]*为：• 当a>0时，[200]*为：
a a1
3.明场相观察： 选取一合适的晶粒→调出其SEDP→调到双束条件状态（位向）→ 加O.L.A（一般用3#即可）→按下S.A按纽即I.L物面下调到O.L像面上 →O.L微调焦（focus按纽）使O.L像面与I.L物面严格重合（像最清晰） 即可观测。 另一方法为：选好一晶粒→低速倾动试样使其缓慢变暗，同时显 现出很多精细组织结构进行观测，此时也大致满足近似双束条件，但 工作晶面不知。 4.中心暗场像观察： 将“Beam Tilt”旋纽复位回到0状态（此时依次按下Bright及Dark 按纽，不论是显微像还是SEDP都不会变化→ 在明场像中选定合适的晶 粒→ 调出其SEDP→ 倾动试样使一最靠近（000）的衍射斑（hkl）处 于满足Bragg方程 = 状态→ 按下Dark按纽 →调节Beam Tilt按纽使整 个衍射谱平移直至 hk l 弱斑点移至屏中心取代(000)斑→ 加物镜光阑 套住屏中心的 hk l → 按下S.A模式按纽即得该晶粒的中心暗场像 （对其它晶粒不适用）
<001>G//<001>
<111>G//<111>
从下图可知，只要 SAA 、 I.L 的物面及 O.L 的像处于同一个平面 A’B’上，则所有衍射斑都是由AB选区中的物质所产生。而AB之 外的物质所发出的任何衍射线均不能穿过A’B’选区光栏孔，因此 在荧光屏上不会出现其衍射斑（在后焦面上当然有）。
二、 步骤 双喷（纯Al,18-8不锈钢使用通用双喷液：4％高氯酸酒精溶液，20℃） 操作过程：试料→ 线切割（～0.5mm厚）→ 机械减薄至～ 0.3mm左右→ 化学减薄至～0.2mm→ 冲样φ30mm →抛磨边沿毛 刺→ 丙酮浸洗→ 双喷电解抛光：本试样条件：75V、-20℃ →穿 孔即停电→ 无水酒精浸洗4次→ 丙酮中清洗一次→ 干燥后（滤 纸吸干）备用。 C萃取复型：制作腐蚀前的金相试样 →选用能保留萃取相的腐蚀 剂作略深于金相样的腐蚀 →在无水酒精中反复清洗 →喷碳→ 在 喷C面划成3×3mm2的方格→ 用原腐蚀液电解脱C膜→ 在无水酒 精中先后清洗3次以上→用标准C网捞取C膜置于滤纸上干燥备用。