复合池塘循环水养殖系统微生物群落结构分析
池塘循环水生态养殖效果分析
池塘循环水生态养殖效果分析
池塘循环水生态养殖是一种绿色、环保、节能、高效的生态养殖技术。
在此系统中，利用微生物经过光合作用、硝化作用、脱氮作用等过程对水体中的有机物、氨氮等有害物质进行处理，再通过循环系统将水重新注入养殖池中，实现了水的循环利用，达到了提高水质的目的。
这种养殖模式可以显著减轻养殖池的底泥积累，减少养殖时使用的水源，提高养殖效率和产量。
池塘循环水生态养殖的主要优点如下：
1. 减少化肥使用。
在池塘循环水生态养殖中，通过微生物的作用，体内、池水中有机物和氮磷等营养元素能被利用，减少了化肥的使用，减轻了对环境的污染。
2. 减少水的损耗。
在此系统中，水被循环利用，避免了水的大量被浪费。
3. 减少污染物的排放。
由于循环系统使作业水循环利用，减少了不必要的排放物。
4. 改善水质。
在循环水中增加适量的植物和微生物，使得水体中的有机质和氮磷等营养元素会被消耗和降解，改善了水质条件。
5. 提高养殖效率。
池塘循环水生态养殖中，通过微生物、自然光和特殊的气氛以及其让生物生产得到了很大的提高，提高了养殖收入。
6. 降低养殖成本。
在此模式下，养殖池水的循环利用减少了对水资源的消耗，同时由此带来的水质自净作用能够降低了养殖成本。
综上所述，池塘循环水生态养殖能够显著提高水质，减少污染物的排放，降低养殖成本，同时也能提高养殖效率和产量。
因此，在实际生产和应用中，这一技术将会有着广泛的应用前景。
养殖水体微生物群落调控技术
养殖水体微生物群落调控技术近年来，随着养殖业的发展，水体污染成为了一个亟需解决的问题。
水体中存在的大量有机物和氮磷等营养物质可导致废水的富营养化，从而破坏生态平衡和造成水质的下降。
为了维持水体健康和养殖业的可持续发展，养殖水体微生物群落调控技术应运而生。
本文将探讨该技术的原理、应用和发展前景。
一、养殖水体微生物群落调控技术的原理养殖水体微生物群落调控技术是通过改变和优化水体中微生物的种类和数量，调整微生物群落结构，实现对水体生态系统的修复和调控。
其主要原理如下：1.1 调控氧气供应合理调控养殖水体中的氧气含量是影响微生物生长和代谢的关键因素。
通过增加水中的氧气供应，可以促进好氧细菌的生长，相应地降低厌氧细菌的数量，为水体中有益微生物的繁殖创造良好的环境条件。
1.2 控制有机物和氮磷的输入过量的有机物和氮磷输入是导致水体富营养化的主要原因之一。
通过减少或控制养殖水体中有机物和氮磷的输入，可以降低水体中的营养物含量，减少废水排放对水体的负面影响，从而改善水质条件和微生物群落结构。
1.3 引入有益微生物根据不同的养殖环境和养殖对象，可以引入特定的有益微生物来调控水体微生物群落。
例如，引入某些具有脱氮和脱磷功能的细菌，可以有效降低水中的氮磷浓度，减缓富营养化的进程。
二、养殖水体微生物群落调控技术的应用养殖水体微生物群落调控技术在实际应用中已取得了一定的成功。
以下是该技术在养殖业中的应用案例：2.1 水产养殖中的微生物种类调控针对不同养殖对象的需求，可以通过增加或减少特定的微生物种类来调控水体微生物群落。
例如，对于养殖鱼类来说，可以引入一些益生菌来提高水体中有益菌的比例，增强鱼类肠道内的有益微生物数量，提高养殖效果和饲养水平。
2.2 废水处理中的微生物调控养殖废水中的微生物含量和种类的变化对废水处理起着重要作用。
通过调控废水中的微生物群落结构，可实现废水的降解与净化。
例如，通过培育特定的细菌菌群，可以降解水体中的有机物和氮磷，减少废水排放对自然水体的污染。
多塘湿地组合工艺净化水质效果及微生物群落分析
( Shanghai Waterway Engineering Design and Consulting Co. , Ltd, Shanghai 200120,China)
Abstract: Study on wastewater treatment effect in the lower Shiwuli River by multiple stable ponds combination process. By
效率较低。 深入 分 析 可 知,TN 主 要 是 通 过 反 硝 化 反
机物较 少, 是 导 致 反 硝 化 反 应 不 能 顺 利 进 行 主 要
原因。
TP :湿地 进 水 浓 度 为 0. 45 mg / L,下 游 湿 地 出 水
浓度为 0. 25 mg / L,去除率为 44. 44% ;证明该 工 艺 对
direction: the richness and diversity of microbial populations decrease with the direction of sewage treatment; In the vertical
direction: Except for aerobic ponds, the richness and diversity of microbial populations in the remaining stable ponds are
Kit 试剂 盒 ( OMEGA ) 。 使 用 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳
施,即通过布置生 物 绳 作 为 微 生 物 载 体,用 来 降 解 水
的 V3 ~ V4 高 变 区 片 段 进 行 PCR 扩 增, 引 物 序 列 为
池塘鱼菜立体种养系统的微生物群落结构分析
第36卷第3期2021年6月Vol.36No.3June2021大连海洋大学学报JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYD0I：10.16535/ki.dlhyxb.2020-131文章编号：2095-1388（2021）03-0454-08池塘鱼菜立体种养系统的微生物群落结构分析邱楚雯，袁新程，施永海”，王韩信，谢永德，徐嘉波，税春（上海市水产研究所上海市水产技术推广站，上海200433）摘要：为了解池塘鱼菜立体种养系统中微生物的群落结构特征，探究池塘鱼菜立体种养系统不同组成之间的相互关系，采用Illumina MiSeq高通量测序方法对系统不同组成的微生物16S rRNA V3~V4区进行测序，比较分析了水体、底泥、蕹菜Ipomoea aquatica Forsk根际与根表、暗纹东方鲀Takifugu obscures肠道及凡纳滨对虾Litopenaeus vanname肠道微生物群落多样性及差异。
结果表明：池塘鱼菜立体种养系统的6组样品细菌分布于62门1503属，优势菌门包括变形菌门Proteobacteria（27.71%）、放线菌门Actinobacteria（16.37%）、蓝细菌门Cyanobacteria（16.05%）和拟杆菌门Bacteroidetes（10.07%）,主要优势菌属包括红球菌属Rhodococcus、葡萄球菌属Staphylococcus、弓形杆菌属Arcobacter、红杆菌属Rhodobacter、硫杆菌属Thiobacillus和支原体属Mycoplasma；水体的优势菌门为放线菌门、变形菌门、蓝细菌门和拟杆菌门，底泥的优势菌门为变形菌门和拟杆菌门，蕹菜根际及根表的优势菌门为变形菌门、蓝细菌门和拟杆菌门，暗纹东方鲀肠道的优势菌门为厚壁菌门Firmicutes、Epsilonbacteraeota、蓝细菌门和拟杆菌门，凡纳滨对虾肠道的优势菌门为放线菌门和变形菌门；池塘鱼菜立体种养系统中的功能性细菌分布略有不同，蕹菜根表硝化细菌的相对丰度显著高于水体、鲀肠道和虾肠道（P<0.05）,蕹菜根际反硝化细菌的相对丰度显著高于其他各组（P<0.05）,水体和蕹菜根际固氮菌的相对丰度显著高于虾肠道、底泥和鲀肠道（P<0.05）。
关于池塘内循环流水生态养殖的分析
关于池塘内循环流水生态养殖的分析杨斌1李其国2S h u i c h a n y u y e 近年来，我国的渔业发展受到限制，水域环境恶化，水产养殖空间缩小，导致养殖产业成本提高，获得的经济收入降低。
政府加大对生态养殖的关注度，提出池塘内循环流水养殖模式，不断创新水产生态养殖理念，旨在推动水产养殖行业的可持续发展。
贵州地区鱼类丰富，经济鱼类多达34种，国家级保护鱼类资源丰富。
贵州的淡水养殖水域面积大，水产养殖种类包括草鱼、鲤鱼、鲢鱼等。
养殖方式包括网箱养殖、围栏养殖等。
贵州地区践行池塘内循环流水生态养殖模式，发展生态渔业，实现了经济、技术、生态等效益的多赢。
一、池塘内循环流水养殖模式概述池塘内循环流水养殖模式属于复合型养殖模式，实现了多营养和分区域养殖系统的综合运用。
在池塘内循环流水养殖系统中养殖鱼类，集污系统可处理杂质，保持水质的清洁。
循环流水养殖模式为鱼类提供了丰富的营养物质，保持水体洁净的同时避免了水域的营养化。
基于先进技术和智能化设备的辅助，池塘内循环流水养殖模式的工作效率大幅提升，改变了传统水产养殖的弊端，进行集约化养殖，循环流水活化池塘水域，降低鱼类生活环境的污染度。
利用池塘内循环流水养殖模式，合理划分池塘的功能区域，实现分级利用，构建了相对独立的生态水域系统，实现增产增收的养殖目标。
二、池塘内循环流水生态养殖的优势分析池塘内循环流水生态养殖模式具有环保无污染的特点。
水产养殖过程中废物的排放量极低，降低了环境压力，提高了水产养殖的生态效益。
池塘内循环流水生态养殖具有提升鱼产品品质，提高经济效益的优势。
池塘内循环流水生态养殖模式采用全过程监管，确保了水产养殖的安全性。
生态养殖满足现代化产业转型要求，大规模降低了人力、物力的损耗。
循环流水养殖模式使用了先进的养殖技术，投资适中，获得的收益较大，值得进行推广使用。
池塘内循环流水生态养殖有效的收集水体中的废物，实现循环利用，提高了资源的使用效率。
池塘循环水生态养殖效果分析
池塘循环水生态养殖效果分析1东平县循环水生态养殖开展趋势随着东平湖内投诱饵的网箱网围全部取消，根据社会的开展，市场的需要，加快滨湖池塘的标准化整理改造，探索出适合东平县经济水平的水产养殖方案，引导渔民转产转业，开展环境友好型、资源节约型的现代循环水生态养殖模式是十分必要的。
目前，东平县开展的池塘循环水生态养殖在理论研究和实践上都有了非常明显的突破。
政府对这个系统予以关注，并定时派专业人士进展引导，在政策上积极进展扶持，使设施设备得到完善，促进了此项养殖技术更快更好的开展。
2池塘循环水生态养殖的模式这种养殖模式的原理主要是在大水面池塘中按2%面积建立循环水生态养殖系统，利用气提式推水机产生循环水，模拟流水生态环境，采用微孔增氧技术、水位调控、水质调控等多项技术进展养殖。
池塘循环水系统内采用了微孔增氧纳米管曝气技术，按照养殖品种和设计产量确定功率和安装微孔增氧设备。
在设施外的养殖水面利用水草、鲢鳙鱼等水生动植物净化水质，利用微生物制剂与微孔增氧双微调控水质，从而改善养殖水体环境、提高养殖产量、降低发病率、增加养殖效益。
同时，发电机也是不可或缺的，用来防止突然断电而造成缺氧死亡的现象，尤其是养殖后期养殖槽内鱼类密度很高，增氧设备不可断电。
东平县年主要进展草鱼、鲤鱼试验养殖，在3个养殖槽中养殖，7月份放苗，其中2个养殖槽养殖草鱼，7月上旬放养0.75～1kg/尾鱼种5000kg；1个养殖槽养殖鲤鱼，7月底放养0.8～1kg/尾鱼种2650kg。
经试验成功后，年放养了鲈鱼、翘嘴红鲌、黄河鲤鱼、草鱼、罗非鱼等品种。
3池塘循环水生态养殖特点池塘循环水生态养殖作为新生事物展现出了强大的生命力，有效提高了产量和生产业绩，首先提高了饲料消化吸收率，降低了饲料系数，与此同时降低了单位产量的消耗，提高了养殖产量；其次，减少了病害，提高了养殖的成活率，从根本上保证了养殖水产品的平安性能；一、有效收集养殖鱼类排泄的废物和剩余的饲料残骸，到达了养殖水体零排放的目的，解决了水产品养殖水体富营养化和污染问题；二、实现了多鱼种主养，防止了单一品种养殖的风险性，同时也可以进展同一品种的多规格养殖，均匀上市，加速了资金的流转；最后，实现了室外池塘集约化养殖管理和物联网监控，推动了中国渔业现代化。
复合池塘循环水养殖系统微生物群落结构分析
复 合 池 塘 循 环 水 养 殖 系 统 (Integrated Pond Recirculating Aquaculture System, IPRAS)是运用 生态学原理 , 将人工湿地、生态沟渠、生物塘等 生态工程技术和池塘养殖有机结合构建的一种具 有节水和生态安全的新型池塘养殖系统 。研究 结果表明 , 该系统作为一种新的池塘养殖生产方 式, 在提高养殖产品品质, 改善养殖产品质量, 节约水资源及有效解决废水排放等方面均具有明 显的理论和实践意义 [2]。 微生物作为营养物质的分解者和转化者、物 质和能量的贮存者[34]以及食物链中重要生产者[5], 在池塘养殖过程中具有重要作用 , 它的群落结构 不仅构成水体物质循环基础 , 而且明显指示水环
研究结果表明该系统作为一种新的池塘养殖生产方在提高养殖产品品质改善养殖产品质量节约水资源及有效解决废水排放等方面均具有明显的理论和实践意义微生物作为营养物质的分解者和转化者物质和能量的贮存者在池塘养殖过程中具有重要作用它的群落结构不仅构成水体物质循环基础而且明显指示水环境质量变化
中国水产科学 2011 年 3 月 , 18(2): 407415 Journal of Fishery Sciences of China DOI: 10.3724/SP.J.1118.2011.00407
[9]
地由一组 L×W×H 为 30 m×8.5 m×0.6 m 的床体 , 填埋碎石作为基质 , 深度 0.6 m, 沿水流方向分别 栽种美人蕉 (Canna indica)、鸢尾 (Iris tectorum)和 菖蒲 (Acorus calamus) 3 种湿生植物 , 初始栽种密 度均为 8~10 株 /m2。养殖单元为一组由 5 口池塘 (P1−P5)用涵管相互串联组成 , 每口池塘面积均为 1 000 m2, 水深 1.8 m; 生态沟渠起联通作用 , 为 L×W×H＝ 200 m×0.54 m×0.62 m, 沟内置易于藻 类附着的载体 , 湿地出水水中溶氧不足现象得到 明显改善。与此同时 , 设对照塘 1 口 (P6), 未参与 试验过程中 , 系统水交 循环 , 池塘面积 1 000 m2。 换量维持在 10%~15％。 池塘主养黄颡鱼 , 鱼种体 质量 8~10 g, 放养密度为 9.0×104 尾 /hm2, 混养 规格 20~30 g/尾鲢鳙夏花鱼种 3.0×103 尾 / hm2 以 调节水质 , 鱼种放养前用 3%食盐水浸洗 10 min 左右 , 全程投喂全价商品黄颡鱼浮性饵料 , ( 商品 标号 Q/ZZ013-2008, 由浙江中大饲料有限公司生 产 ), 养殖过程中池塘管理方式一致。
72循环水养殖系统_RAS_生物载体上微生物群落结构变化分析
第32卷第1期2011年1月环境科学ENVIRONMENTAL SCIENCEVol.32，No.1Jan.，2011循环水养殖系统（RAS ）生物载体上微生物群落结构变化分析张海耿1，2，马绍赛2*，李秋芬2，傅雪军1，2，张艳2，曲克明2（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，山东省渔业资源与生态环境重点实验室，青岛266071）摘要：为研究循环水养殖系统（recirculating aquaculture systems ，RAS ）生物滤池挂膜及运行过程中生物载体上微生物群落结构的变化及其脱氮机制，采用传统微生物培养方法，对不同时期生物载体上的异养细菌、氨氧化细菌及硝化菌进行培养计数.并通过变性梯度凝胶电泳技术，对细菌的16S rDNA V3可变区的PCR 扩增片段进行分离，分析了所得到的细菌群落特征DNA 指纹图谱，对其中的优势菌属使用序列数据进行同源性分析并建立系统发育树.结果表明，随着时间的推移，3类细菌的数量都呈现出先增加后逐渐降低直至达到稳定的趋势.各个时期生物载体上微生物群落的组成非常丰富，Shannon 指数分别为1.53、1.44、1.57、1.08、1.27和1.30.不同时期生物载体上微生物的种类有一定的变化，但2个相邻时期的C s 值（相似性指数）都比较高，说明微生物群落的变化与演替是缓慢而有规律的.生物载体上存在多类细菌共同作用于养殖水体污染物的去除，出水水质能达到高密度养殖的要求，其主要优势种群以Proteobacteria 和Flavobacteria 为主，分离鉴定出了亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas ）及黄杆菌（Flavobacteriaceae bacterium ）等兼性厌氧细菌，表明生物滤池中可能同时存在硝化和脱氮途径.关键词：生物载体；生物挂膜；微生物群落结构；循环水养殖系统（RAS ）；PCR-DGGE中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：0250-3301（2011）01-0231-09收稿日期：2010-03-31；修订日期：2010-06-17基金项目：国家科技支撑计划项目（2006BAD09A03）；国家高技术研究发展计划（863）项目（2006AA100305）作者简介：张海耿（1986 ），男，硕士研究生，主要研究方向为循环水养殖及水处理，E-mail ：zhanghaigeng1986@ *通讯联系人，E-mail ：mass@Analysis of the Changes of Microbial Community Structure on Bio-carrier ofRecirculating Aquaculture Systems （RAS ）ZHANG Hai-geng 1，2，MA Shao-sai 2，LI Qiu-fen 2，FU Xue-jun 1，2，ZHANG Yan 2，QU Ke-ming 2（1.College of Fisheries and Life Science ，Shanghai Ocean University ，Shanghai 201306，China ；2.Key Laboratory for Sustainable Utilization of Marine Fisheries Resources ，Ministry of Agriculture ，Shandong Provincial Key Laboratory of Fishery Resources and Eco-environment ，Yellow Sea Fisheries Research Institute ，Chinese Academy of Fishery Science ，Qingdao 266071，China ）Abstract ：In order to study the variation of microbial community structure and the mechanism of denitrification on bio-carrier in recirculating aquaculture systems （RAS ）during the periods of bio-film formation and operation the systems ，traditional microbiological methods were applied to count the quantity of heterotrophic bacteria ，ammonia oxidize bacteria and nitrite oxidize bacteria.The amplified products of variable V3region of bacterial 16S rDNA were separated by using denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE ）.And bacterial community DNA fingerprint was obtained.The sequences retrieved from the DGGE bands were used for homology analysis and construction of phylogenetic tree.It presented a trend that the quantity of the three types of bacteria increased gradually to a top and then fallen slowly to a stable level.The composition of microbial community of bio-carrier was very abundant in all periods ，and the Shannon index was 1.53，1.44，1.57，1.08，1.27and 1.30，respectively.During different periods ，there was a certain shift in the microbial community structure ，while the C s value （similar index ）in two adjacent periods was high ，indicating the variation and succession of the microbial community was slow and regular.Several bacteria had an effect on removal of pollutants for farming water and the effluent water quality could meet the requirements of high-density culture.Among them ，Proteobacteria and Flavobacteria were main communities.The Nitrosomonas and some other facultative anaerobic bacteria （Flavobacteriaceae bacterium ）were identified ，which indicated that there may be coexisted pathways of nitrification and denitrification in bio-filter.Key words ：bio-carrier ；bio-film formation ；microbial community structure ；recirculating aquaculture systems （RAS ）；PCR-DGGE循环水养殖系统（RAS ）因其具有高效、可控、节水省地、对环境污染小等特点，正逐渐在世界各国水产养殖业中得到重视和应用，它汇集水产养殖学、微生物学、环境科学、信息与计算机科学等众多学科知识于一体，是未来水产养殖业可持续发展的主要方向之一.RAS 中水处理单元之一的生物滤池对控制整个系统中的有机物、NH +4-N 、NO －2-N 和NO －3-N 浓环境科学32卷度起着关键作用［1］，而生物滤池里生物膜的培养与维护是整个系统有效运行的重要环节，也是水处理研究中的难点和热点.近年来国内外的一些学者对RAS 的构建进行了大量的研究，对各个水处理单元的工艺设计与具体参数也有了深入的认识［2 4］.但对于RAS 运行时生物滤池里的微生物群落结构的研究报道较少，而生物膜上各时期细菌的群落结构变化和代谢情况与养殖循环水中营养物质的去除效果是紧密相关的.现代分子生物学为深入研究环境中的微生物提供了先进的技术手段，其中变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis ，DGGE ）技术通过不依赖分离培养的核酸信息来检测微生物群落的复杂性，已被广泛地用于比较微生物群落的多样性和监视种群动态［5 7］.运用此技术研究RAS 生物滤池中微生物群落的报道还很鲜见.本研究采用微生物传统培养方法并结合PCR-DGGE 技术对RAS 生物膜各个时期的微生物群落结构进行了分析，旨在摸清RAS 生物载体上微生物群落结构变化、种类及作用，以期为RAS 生物膜的维持及其高效运行提供依据和保障.1材料与方法1.1RAS 处理工艺封闭RAS 由山东海阳市黄海水产有限公司2008年改建而成，其水处理工艺流程如图1所示，由养鱼池、微滤机、臭氧-蛋白质分离器、生物滤池、紫外线消毒、高效液态氧及水质在线监测七大部分组成.其中生物滤池内均匀悬挂生物载体，该载体是利用化学纤维丝条（直径为0.5mm ，比表面积约为360m 2/m 3）加工而成，形似毛刷，具有弹性，不仅能使自然微生物均匀地附着在每一根丝条上，而且能使氧气、水、自然微生物之间充分接触，获得较大的比表面积.系统运行前利用养鱼水中的自然微生物辅助一定的微生态制剂及营养盐进行生物挂膜.由于养鱼池水体蒸发及排污等均会导致系统内水体的损失，因此，每天需补充总水体10%的水量，以保持系统水位的平衡和稳定.1.2样品的采集图1封闭循环水养殖系统水处理工艺流程Fig.1Water treatment process of closed recirculating aquaculture system从生物挂膜开始，每隔1周在生物滤池中剪取2份10g 左右的生物载体，放入50mL 离心管中，并立即存放于冰盒，带回实验室，一份在48h 内将菌种接种到培养基上，另一份暂时存放于－20ħ冰箱，等样品全采集完了一起提取基因组总DNA.同时定期剪取生物载体在显微镜下观察挂膜情况.所用取样器具均进行了灭菌处理.样品共采集6次，生物膜形成过程期间4次，编号为A1 A4；生物膜成熟后，在循环水系统运行期间取样2次，编号为B1、B2.1.3细菌的培养计数异养细菌的培养采用平板涂布法（2216E 培养基）［8］，28ħ下培养48h 后计数.氨氧化细菌和硝化菌的培养采用MPN 法计数，先将样品放于装有90mL 无菌陈海水的玻璃瓶中，充分振荡混匀，然后再逐级稀释4个浓度梯度，每个梯度设置5个平行.取1mL 稀释液加入到装有氨氧化细菌培养基和硝化菌培养基［8］的试管中，28ħ暗培养28d ，用Griesst2321期张海耿等：循环水养殖系统（RAS）生物载体上微生物群落结构变化分析和二苯胺试剂进行检测，根据检测结果查MPN表［9］，然后推算每g生物载体上细菌的数量.1.4生物膜总DNA的提取与纯化采集的生物载体样品解冻后，加入5mL灭菌蒸馏水，高速涡旋振荡5min；加入1mL250mmol/LTris-HCl（含100mg溶菌酶）和4mL DNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，pH8.0）；30ħ振荡30min；37ħ再振荡30min；加入20μL蛋白酶K （100mg/mL），37ħ振荡1h；加入20%的SDS溶液100μL，85ħ水浴30min，每10min轻轻颠倒3次；5800r/min，室温离心15min，取上清液于另一50 mL离心管中；加入1/2体积的7.5mol/L乙酸铵，轻轻混匀，冰上放置15min；7600r/min4ħ离心15 min，取上清液于另一50mL离心管中；加入2倍体积无水乙醇并在－20ħ沉淀过夜；7600r/min4ħ离心30min，弃上清液；用2mL70%乙醇清洗；7600r/min4ħ离心10min，用2mL95%乙醇清洗，7600r/min4ħ离心10min，将沉淀用无菌水重新溶解，即获得DNA初提液.所得DNA初提液采用Takara公司的胶回收试剂盒进行纯化.电泳检测所得的基因组DNA片断大小略大于20kb，与细菌基因组的大小相同［10］，以此为模板，进行PCR扩增.1.5PCR扩增及变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析采用由上海生工生物工程有限公司合成的细菌16S rDNA通用引物U341F（5ᶄCCTACGGGAGGC AGCAG3ᶄ）［11］和U758R（5ᶄCTACCAGGTATCTAA TCC3ᶄ）［12］直接对总DNA进行PCR扩增，其中在U341F的5ᶄ端有50bp GC（5ᶄCGCCCGCCGCGCG CGGCGGGCGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG GCAG3ᶄ）［12］，用于后续的DGGE.PCR扩增体系（50μL）：dNTP（2μmol/L，Fermentas）为5μL，10倍反应缓冲液（不含MgCl2）为5μL，MgCl2（25mmol/L，Fermentas）为3μL，BSA（Amresco，USA）溶液（20mg/mL）为 1.0μL，引物各为 1.0μL （25μmol/L），Taq DNA聚合酶（Fermentas）0.5μL，模板为2μL（稀释5倍），最后加灭菌的Milli-Q 水至体积为50μL.PCR反应在Mastercycler gradient （eppendorf）上进行，反应采用降落式PCR策略［13］，即95ħ预变性5min，然后94ħ变性1min，65ħ退火1min，72ħ延伸2min，每个循环退火温度降低1ħ直至55ħ，循环10次；然后94ħ变性1min，55ħ退火1min，72ħ延伸2min，循环20次，在72ħ保持10min，最后4ħ保温.以上PCR产物经1.4%琼脂糖电泳检测均可得到一条清晰的目标条带，用E.Z.N.A.TM胶回收试剂盒（Omega Bio-tek）回收，溶解于无菌水中.取12μL纯化后的PCR产物（约800ng）在通用突变检测系统（Bio-Rad，USA）上进行电泳，变性梯度范围为30% 65%，聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，电压为80 V，电泳时间为16h，温度恒定在60ħ.电泳结束后，凝胶以0.5μg/mL的SYBR Green溶液染色，洗涤数次后于Gel Doc1000凝胶成像系统（BioRad，USA）上成像观察、拍照.1.6PCR-DGGE图谱统计分析根据DGGE图谱上条带的强度（用吸光度表示）和位置，由式（1）计算各个样品的多样性指数（Shannon指数，H）［14］，由式（2）计算2个样品之间的相似性指数（Cs）［15］.H=－Σ（n i/N）lg（n i/N）（1）式中，ni为样品上各个条带吸收峰的面积；N为样品上所有条带吸收峰的总面积.CsAB=2LAB/（LA+LB）ˑ100（2）式中，CsAB为泳道A和泳道B之间的相似性系数；LAB为泳道A上的与泳道B上位置相同的条带数；LA为泳道A上的条带数；LB为泳道B上的条带数.1.7目的条带回收、重扩增、测序及序列系统发育树构建在蓝光照射下切下DGGE胶上比较亮的特征条带，浸泡于60μL无菌水中，37ħ过夜，以上清液作为重扩增的模板.取1μL模板（条带回收原液稀释2倍）用不带GC发夹结构的引物进行PCR扩增.用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，确认为单一条带后，送交生物公司（三博，北京）测序.使用GenBank 的Sequin win32软件将测序结果提交给GenBank注册，并获得接受号（GU992422 GU992454）.使用NCBI的BLAST（http：/// blast/）对所得序列进行同源性分析，并使用ClustalX1.83软件进行多序列匹配排列（Multiple alignments），通过MEGA3.1采用邻接法（neighbour-joining-analysis）构建系统发育树.2结果与讨论2.1生物膜生长及系统运行情况生物滤池中生物膜的培养与成熟是RAS能否正常运行的关键.微生物在载体表面附着并实现固定化是微生物表面与载体表面间的相互作用过程，332环境科学32卷它与微生物的自身特性有关，同时也与固定载体的物理化学特性及环境因素（pH 值、离子强度、水力剪切力、温度等）密切相关［16］.该系统生物滤池中的pH 稳定在7.5 8.0之间，DO ≥5mg /L ，盐度为30，水温控制在24.0ħʃ2.0ħ之间.生物膜培养直接采用养鱼池的水，在生物挂膜初期，为了使自然微生物能够快速生长并附着于生物载体，添加了一定量的微生态制剂和营养物质（C 6H 12O 6、CO （NH 2）2、NH 4Cl 、NaNO 2、K 2HPO 4、Na 2HPO 4、MnSO 4等）.定期剪取生物载体在显微镜下进行观察，第1 7d ，白色的生物载体表面开始有浅黄色的斑点出现；第7 14d ，生物载体表面形成一层呈黄褐色状的薄膜物质，镜检发现载体上的菌类增加，开始以菌胶团的形式存在；第14 21d ，生物载体上的附着物生长增快，颜色由黄褐色慢慢变成深黄色，镜检发现载体上布满菌胶团；第21 28d ，生物膜的颜色继续加深，菌胶团的厚度也进一步增加，标志生物膜已成熟.挂膜4个星期后，进行封闭循环水养殖半滑舌鳎，日循环为5 6个量程，生物滤池的水力停留时间约为3h.连续一个月每天监测生物滤池进出口水的NH +4-N 、NO －2-N 、NO －3-N 和COD 浓度的变化，系统运行稳定.养殖水先经过该系统微滤机和臭氧-蛋白质分离器的处理后，其养殖水体污染物的浓度，特别是COD 负荷已不是很高，生物滤池能够在较低进水NH +4-N 、NO －2-N 、COD 的负荷下，起到较好的去除NH +4-N 、COD 、NO －2-N 作用，使养殖水体污染物的浓度在运行过程中维持较低的水平（图2、3），经过生物滤池后的水质能达到高密度养殖的要求.图2生物滤池对NH +4-N 、COD 和NO －2-N 的去除率Fig.2Remove ratio of ammonia-nitrogen ，chemical oxygendemand and nitrite-nitrogen图3生物滤池出水水质状况Fig.3Effluence water quality of bio-filter2.2生物载体上细菌的动态变化由表1可看出，挂膜1周，细菌便开始大量地繁殖与生长起来，随着挂膜天数的增加，3大类细菌都呈现出先增加后逐渐减少直至达到稳定的趋势.异养细菌先于其它细菌生长起来，并且高出1 2个数量级，可能是由于其对氧和营养竞争占优势.与异养细菌相比，氨氧化细菌和硝化菌虽都能在氧化过程中获得生长所需要的能量，但其能量利用率不高，故生长较缓慢，其平均世代（即细菌繁殖一代所需要的时间）在10h 以上［17］.挂膜成熟后系统运行期间生物滤池中载体上异养细菌的数量为4.10ˑ106CFU /g ，与Leonard 等［18，19］报道的狼鲈循环水养殖系统生物滤器中载体上的异养细菌数量为106CFU /g 和105CFU /g 基本一致.氨氧化细菌表现出稳定生长的状态，在生物挂膜期及系统运行过程中对NH +4-N 的去除一直很明显.硝化菌在挂膜第28d ，数量达到顶峰，NO －2-N 浓度开始下降，这是生物膜成熟的标志.此时微生物代谢旺盛，水的净化能力强，出水水质良好.2.3细菌群落指纹图谱分析不同时期细菌群落16S rDNA 的PCR 反应产物的DGGE 图谱如图4所示，其中编号A1 A4为生物膜形成过程期，B1、B2为循环水系统运行期.6个样品生物多样性指数（H ）都较高（表2），在生物挂膜初期，最先适应此环境的细菌迅速繁殖起来.A1期的H 值比较高，而后有所降低，在A3期H 值达到最高，说明经过一段时期的培养，有更多种类的细菌附着到载体上，如band 12、band 22等，其种类与数量都达到顶峰.而后在A4期其H 值有一定的下降，4321期张海耿等：循环水养殖系统（RAS ）生物载体上微生物群落结构变化分析是因为此时生物滤池里的营养盐浓度很低，特别是无机氮浓度已低于养鱼池水的浓度，大量的细菌竞争，导致有些细菌无法继续在载体上生长而被淘汰脱落，如band 8、band 9等.系统运行后，生物滤池中的营养盐浓度趋于稳定，一部分细菌在竞争中淘汰后，另一些细菌慢慢成为优势种群，如band 27、band 28等，其H 值也逐渐趋于稳定.在6个样品的图谱中，有些条带是一直出现的，如band 18、band 19等，这些可被视为生态幅较为广泛的种属，在生物滤池这个小型生态系统中对物质和能量的代谢发挥着重要的作用.有些条带，如band 16、band 17在前5个时期都有，在B2期突然消失了，是何原因造成这种现象，还有待进一步研究.随着时间的推移，2个时期的C s 值在逐渐降低，如A1期与A2期的C s 值大于A1期与A3期的C s 值，但是除A4期与B1期C s 值偏低外，其余任何2个相邻的时期C s 值都很大，表明不同时期生物载体上微生物的群落结构是在变化的，但是演替的过程是缓慢而有规律的，这样驯化成功的生物膜不容易脱落，比较稳定（表3）.张斌等［20］对膜-生物反应器中微生物群落结构多样性的演变过程研究表明，接种污泥期与系统运行期间微生物的群落发生了较大的改变，与本研究有所不同，原因可能是其污水处理工艺的改变影响了膜-生物反应器内部微生物种群的结构.表1不同时期生物载体上3类细菌数量的动态变化Table 1Quantity of dynamic variation of three types of bacteria on bio-carrier in different periods细菌类别细菌数量/CFU ·g －17d 14d 21d 28d 40d 50d 异养细菌7.77ˑ105 2.02ˑ107 2.08ˑ1079.04ˑ106 4.10ˑ106 1.43ˑ106氨氧化细菌 6.08ˑ104 4.81ˑ106 6.92ˑ106 1.55ˑ106 3.42ˑ105 2.23ˑ105硝化菌2.11ˑ1043.85ˑ1051.01ˑ1061.12ˑ1071.65ˑ1062.32ˑ106图4不同时期细菌群落组成DGGE 分离图谱Fig.4DGGE profiles of bacterial community composition in different periods表2不同时期生物载体上微生物群落Shannon 多样性指数Table 2Shannon index of microbial population on bio-carrier in different periodsA1A2A3A4B1B21.531.441.571.081.271.30表3不同时期生物载体上微生物群落相似性指数Table 3Comparability index of microbial population on bio-carrier in different periods A1A2A3A4B1B2A1100A282.6100A377.688.4100A446.260.666.7100B144.552.653.758.1100B240.841.943.544.473.21002.4目的条带的系统发育分析生物滤池中细菌的种类繁多，采用细菌16S rDNA 通用引物进行扩增，可以对生物载体上的细菌类群有一个全面的了解.将图4中主要条带进行切胶测序后，在GenBank 中进行比对，获得33条带的同源性信息，除band 6、band 22外，大部分条带所含的DNA 序列与GenBank 中已知序列拥有较高的相似度（>96%），见表4.33条带分别属于变形菌门（Proteobacteria ）的α-、β-、γ-变形菌纲（Proteobacteria ）（17个OTUs ），厚壁菌门（Firmicutes ）的芽孢杆菌纲（Bacilli ）（1个OTUs ）和拟杆菌门（Bacteroidetes ）的黄杆菌纲（Flavobacteria ）（15个OTUs ），见图5.不同时期生物载体上主要的菌属分布情况如表5所示.Proteobacteria 在整个细菌种类中占有了很大的532环境科学32卷表433条带16S rDNA序列比对结果Table4Results of3316S rDNA sequences using BLAST in GenBank条带编号序列长度/bpGenBank接受号GenBank中亲缘关系最近序列细菌GenBank登录号物种名所属细菌类群相似度/%1416GU992422GQ331112Formosa sp.EM151Flavobacteria98 2413GU992423AY883939Gaetbulibacter saemankumensis Flavobacteria98 3412GU992424FJ716799Bizionia sp.KMM6177Flavobacteria99 4416GU992425FJ596337Olleya T050418-038Flavobacteria100 5417GU992426FJ868613Tenacibaculum sp.RAS53Flavobacteria100 6412GU992427AB261012Marixanthomonas ophiurae Flavobacteria95 7402GU992428FJ176555Arenibacter sp.TG409Flavobacteria100 8399GU992429FJ161251Cellulophaga sp.D4012Flavobacteria96 9385GU992430FJ229467Maribacter sp.KLE1063Flavobacteria97 10402GU992431FN330974Weissella cibaria Bacilli100 11392GU992432FJ196064Thalassobius sp.ZS6-18α-Proteobacteria99 12416GU992433EF092216Uncultured Nitrosomonas sp.β-Proteobacteria98 13401GU992434FJ222605Albidovulum sp.S1K1α-Proteobacteria100 14391GU992435FJ161311Thalassobius mediterraneusα-Proteobacteria98 15388GU992436FJ868596Ruegeria sp.RAS15α-Proteobacteria99 16414GU992437FJ161344Nautella sp.D7042α-Proteobacteria100 17389GU992438FJ161324Thalassobius aestuariiα-Proteobacteria96 18398GU992439FJ952830Rhodobacter sp.α-Proteobacteria99 19408GU992440DQ675021Pseudoruegeria aquimarisα-Proteobacteria97 20397GU992441EF033448Alpha Proteobacterium36G5α-Proteobacteria99 21397GU992442DQ915615Oceanicola batsensisα-Proteobacteria99 22391GU992443AF069963Endosymbiont of Acanthamoeba sp.UWC8α-Proteobacteria95 23417GU992444AY167341Psychroserpens sp.ARK10236Flavobacteria99 24384GU992445FM162948Flavobacteriaceae bacterium ACEMC1F-10Flavobacteria98 25399GU992446AM945570Polaribacter sp.MOLA340Flavobacteria98 26410GU992447AM941176Uncultured Pseudoalteromonas sp.γ-Proteobacteria96 27406GU992448FJ868592Agrobacterium sp.RAS8α-Proteobacteria99 28409GU992449FN297835Phyllobacteriaceae bacterium AMV1α-Proteobacteria99 29391GU992450DQ915607Leisingera methylohalidivoransα-Proteobacteria99 30407GU992451FJ425226Winogradskyella sp.K7-7Flavobacteria97 31394GU992452EF988631Maritalea myrionectaeα-Proteobacteria99 32409GU992453AM709741Roseobacter sp.SOEmb11α-Proteobacteria100 33389GU992454FJ786105Uncultured bacteriumα-Proteobacteria97表5不同时期生物载体上主要的细菌种类Table5Species of main bacteria on bio-carrier in different periods时期主要细菌类别条带A1Formosa sp.，Gaetbulibacter saemankumensis，Bizionia sp.，Olleya sp.，Tenacibaculum sp.，Marixanthomonas ophiurae，Arenibacter sp.，Cellulophaga sp.，Maribacter sp.，Weissella cibaria，Thalassobius sp.，Nautella sp.，Rhodobacter sp.，Pseudoruegeria aquimarisBand1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、16、18、19A2Bizionia sp.，Marixanthomonas ophiurae，Cellulophaga sp.，Uncultured Nitrosomonas sp.，Thalassobiusmediterraneus，Ruegeria sp.，Nautella sp.，Rhodobacter sp.，Pseudoruegeria aquimaris，OceanicolabatsensisBand3、6、8、12、14、15、16、18、19、21A3Formosa sp.，Bizionia sp.，Cellulophaga sp.，Maribacter sp.，Uncultured Nitrosomonas sp.，Albidovulumsp.，Thalassobius mediterraneus，Nautella sp.，Rhodobacter sp.，Pseudoruegeria aquimaris，Endosymbiontof Acanthamoeba sp.Band1、3、8、9、12、13、14、16、18、19、22A4Marixanthomonas ophiurae，Uncultured Nitrosomonas sp.，Nautella sp.，Thalassobius aestuarii，Rhodobacter sp.，Pseudoruegeria aquimaris，Psychroserpens sp.，Flavobacteriaceae bacteriumBand6、12、16、17、18、19、23、24B1Uncultured Nitrosomonas sp.，Nautella sp.，Thalassobius aestuarii，Rhodobacter sp.，Pseudoruegeriaaquimaris，Psychroserpens sp.，Flavobacteriaceae bacterium，Polaribacter sp.，UnculturedPseudoalteromonas sp.，Agrobacterium sp.，Phyllobacteriaceae bacteriumBand12、16、17、18、19、23、24、25、26、27、28B2Olleya sp.，Uncultured Nitrosomonas sp.，Rhodobacter sp.，Pseudoruegeria aquimaris，Psychroserpens sp.，Flavobacteriaceae bacterium，Uncultured Pseudoalteromonas sp.，Agrobacterium sp.，Phyllobacteriaceaebacterium，Winogradskyella sp.，Roseobacter sp.Band4、12、18、19、23、24、26、27、28、30、326321期张海耿等：循环水养殖系统（RAS ）生物载体上微生物群落结构变化分析图5基于DGGE 条带16S rDNA 序列的不同时期细菌系统发育树Fig.5Phylogenetic tree of bacteria in different periods based on the 16S rDNA sequences of DGGE bands比例，其主要的细菌类群是α-Proteobacteria 纲.许多学者研究表明［21，22］，α-Proteobacteria 中包含的很多菌属都能生存于不同的环境中.占α-Proteobacteria 一定比例的Rhodobacter 菌群是一种紫色非硫细菌732环境科学32卷（purple nonsulfur bacteria），这种细菌的最大特点是能够利用多种有机物作为碳源进行异养的光合代谢反应［23］，基质利用的多样性使得它们在生物滤池中具有竞争优势，从而成为优势菌属出现在生物膜的不同时期中.β-Proteobacteria一直是废水处理系统中去除含氮污染物最重要的类群［24］，其中的亚硝化螺菌属（Nitrosospira）和亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）是较常见的氨氧化菌［25］.本研究分离得到的与Nitrosomonas sp.相似的细菌在降低氨氮浓度方面起了重要作用，并逐渐成为生物膜上的优势种群.在微生物挂膜期及系统正式运行期，生物滤池对NH+4-N和NO－2-N一直保持一定的去除率，说明生物滤池内部存在着一定的硝化作用.γ-Proteobacteria偏好于高营养盐环境，并且易于吸收低分子量的溶解性有机物［26，27］.RAS运行后，养鱼池水中的营养物质相对比较丰富，经过Pseudoalteromonas sp.这些菌的胞外酶作用，可将营养盐分解成水溶性低分子的氨基酸、单糖和无机酸等.另外，由于硝化作用耗氧以及曝气的不均匀性，生物滤池中总会形成一定程度的低氧或缺氧区域，当DO<2mg/L时，DO可以成为硝化反应的限制因素［28］，这就为反硝化脱氮创造了有利的条件.黄杆菌（Flavobacteriaceae bacterium）等兼性厌氧细菌主要分布于生物膜的内层，在低氧或无氧条件下，它们能利用硝酸盐或亚硝酸盐作为最终电子受体进行无氧呼吸，即异化性硝酸还原作用，在这期间硝酸盐被转化成各种还原性产物，而有机物同时被氧化［29］，这说明在生物滤池中除传统的硝化途径外，同时还存在着好氧或厌氧反硝化作用于硝酸盐的去除过程，从而使生物滤池中硝酸盐的浓度稳定在一定水平.这些功能性的微生物能够较好地适应RAS中的环境，对于水处理效果的提高起了至关重要的作用.若能将这些微生物进行分离培养，以一定的比例同时投加到生物滤池中，可能会实现RAS的“跳跃式启动”［30］.本研究通过PCR-DGGE技术没有分离出大量的氨氧化细菌与硝化菌，这可能与设计的引物有关.针对某一特定功能的亚纲类细菌，采用特异性更强的引物进行Nested PCR-DGGE分析，可能会更加细致地了解这一亚纲类细菌的种类.3结论（1）经过4周左右的生物挂膜，生物载体上形成了微生物种类丰富，群落结构比较稳定的生物膜.不同时期经传统生物培养的异养细菌，氨氧化细菌，硝化菌的数量都呈现出先增加后逐渐减少直至达到稳定的趋势.在RAS运行时，生物滤池能较好地降低水体中NH+4-N、NO－2-N和COD的浓度，使养殖水体污染物的浓度维持在较低的水平.（2）在生物膜形成过程中及系统运行时期，生物载体上的微生物种类有一定的变化，不同时期存在一些各自特有的种属和共有的种属.除A4期与B1期Cs值偏低外，其余任何2个相邻时期的Cs值都很大，说明微生物群落的变化与演替是缓慢而有规律的，从而保证了水处理效果的稳定性.（3）生物滤池中微生物种群分布较为广泛，主要优势种群以Proteobacteria和Flavobacteria为主，存在多类细菌共同作用于养殖水体污染物的去除，其中Nitrosomonas参与了系统的硝化过程，参与反硝化过程的主要是黄杆菌（Flavobacteriaceae bacterium）等兼性厌氧细菌.这些功能性细菌在整个系统的运行中起了非常重要的作用.参考文献：［1］Nijhof M，Bovendeur J.Fixed film nitrification characteristics in sea-water recirculation fish culture 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复 合 池 塘 循 环 水 养 殖 系 统 (Integrated Pond Recirculating Aquaculture System, IPRAS)是运用 生态学原理 , 将人工湿地、生态沟渠、生物塘等 生态工程技术和池塘养殖有机结合构建的一种具 有节水和生态安全的新型池塘养殖系统 。研究 结果表明 , 该系统作为一种新的池塘养殖生产方 式, 在提高养殖产品品质, 改善养殖产品质量, 节约水资源及有效解决废水排放等方面均具有明 显的理论和实践意义 [2]。 微生物作为营养物质的分解者和转化者、物 质和能量的贮存者[34]以及食物链中重要生产者[5], 在池塘养殖过程中具有重要作用 , 它的群落结构 不仅构成水体物质循环基础 , 而且明显指示水环
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境质量变化 [6]。传统微生物种群结构研究一直建 立在传统分离和培养方法上 , 这种方法费时费力 , 培养种群数量有限 , 不能代表整个微生物群落结 构。变性梯度凝胶电泳 (Denatured Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)是基于 16S rDNA 保守性 的 DNA 指纹技术 , 能避开分离培养途径的不足 , 可以原 位研 究微生 物群 落结构 组成 。该技 术 从 1993 年被 Muyzer 等 [7]首次用来分析土壤环境微 生物区系以来 , 已被广泛应用于各种环境微生物 生态学研究 [8], 并已发展成为目前研究微生物群 落结构的主要分子生物学方法。PCR-DGGE 技术 可以使碱基序列稍有区别的 PCR 扩增产物在变性 剂浓度逐步提高的聚丙烯酰胺凝胶中具有不同的
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地由一组 L×W×H 为 30 m×8.5 m×0.6 m 的床体 , 填埋碎石作为基质 , 深度 0.6 m, 沿水流方向分别 栽种美人蕉 (Canna indica)、鸢尾 (Iris tectorum)和 菖蒲 (Acorus calamus) 3 种湿生植物 , 初始栽种密 度均为 8~10 株 /m2。养殖单元为一组由 5 口池塘 (P1−P5)用涵管相互串联组成 , 每口池塘面积均为 1 000 m2, 水深 1.8 m; 生态沟渠起联通作用 , 为 L×W×H＝ 200 m×0.54 m×0.62 m, 沟内置易于藻 类附着的载体 , 湿地出水水中溶氧不足现象得到 明显改善。与此同时 , 设对照塘 1 口 (P6), 未参与 试验过程中 , 系统水交 循环 , 池塘面积 1 000 m2。 换量维持在 10%~15％。 池塘主养黄颡鱼 , 鱼种体 质量 8~10 g, 放养密度为 9.0×104 尾 /hm2, 混养 规格 20~30 g/尾鲢鳙夏花鱼种 3.0×103 尾 / hm2 以 调节水质 , 鱼种放养前用 3%食盐水浸洗 10 min 左右 , 全程投喂全价商品黄颡鱼浮性饵料 , ( 商品 标号 Q/ZZ013-2008, 由浙江中大饲料有限公司生 产 ), 养殖过程中池塘管理方式一致。
6 至 10 月 , 频率 1 次 /月 , 采样点包括 5 级循环塘 和 1 个对照塘。各塘水质理化指标用采水器随机 选取 3 个位点 , 取等量水样混合带回实验室分析 , 其中水温 (T)、 pH 值和溶氧 (DO)等用美国奥立龙 水质分析仪在线测定 ; 铵氮 (NH4 -N)、总氮 (TN)、 《水和废 总磷 (TP)和高锰酸盐指数 (CODMn)测定按 水监测分析方法》
样品采集与处理 采样设计与测试指标 采样时间为 2008 年
表月份 , 依此类推将样品进行编号。 1.2.2 DNA 提取 用 0.22 μm 的滤膜过滤 200 mL 水样 , 在无菌条件下将滤渣用 TE 水 (10 mmol/L Tris-HCl+1 mmol/L EDTA, pH 值为 8.0)在培养皿 中洗下来 , 在 10 000 r/min 条件下离心 10 min, 收 集沉淀物保存于 20℃。所有样品在提取 DNA 之 前需完全解冻。 DNA 提取参照 Zhou 等 [11]的方法。 粗提的 DNA 溶液 , 用上海申能博彩 3S 纯化柱纯 化后 , 置于 20℃保存。 1.2.3 PCR 扩增 使用细菌通用引物 : 341F-GCclamp(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC
1. 中国水产科学研究院 长江水产研究所 , 湖北 荆州 434000; 2. 上海海洋大学 水产与生命学院 , 上海 201306 摘要 : 于 2008 年 6 至 10 月逐月调查研究了新型复合池塘循环水养殖系统各塘水体理化和微生物分子特征。通过 提取水样中细菌总 DNA, 扩增其 16S rDNA 基因 V3 区 , 再经 DGGE 分析获得图谱 , 选择其中主要的 13 条特征条 带进行克隆测序。研究结果表现为 , 随水流方向 (P1→P5), 各循环塘溶氧 (DO) 和透明度 (SD) 依次呈明显下降趋势 , TP 和 CODMn 水平呈明显上升趋势 ; 与对照塘相比 , 循环塘 DO 和 SD 升高 , CODMn 和营养盐水平降低。 而 NH4+-N、 DGGE 图谱分析显示 , 各养殖塘微生物种类丰富 , 循环塘与对照塘的群落结构存在明显差异 , 且差异主要表现在 较弱的条带上 ; 13 条特征条带的测序结果表明 , 池塘优势菌群分属 4 个门 : 放线菌门 (Actinobacteria)、变形菌门 (Proteobacteria)、蓝细菌门 (Cyanobacteria)和拟杆菌门 (Bacteroidetes), 其中有 2 条属于蓝细菌门的条带特定分布于 对照塘。典型对应分析 (CCA)排序结果显示 , DGGE 图谱条带分布与理化因子密切相关。与传统池塘养殖相比 , 该 养殖模式有助于改善养殖池塘微生态环境。本研究旨为池塘微生物群落结构及其功能关系研究提供借鉴。[中国水 产科学 , 2011,18(2): 407415] 关键词 : 复合池塘循环水养殖系统 ; 微生物群落结构 ; 人工湿地 ; DGGE 中图分类号 : S94 文献标识码 : A 文章编号 : 10058737(2011)02040709
中国水产科学 2011 年 3 月 , 18(2): 407415 Journal of Fishery Sciences of China DOI: 10.3724/SP.J.111塘循环水养殖系统微生物群落结构分析
姚延丹 1,2, 李谷 1, 陶玲 1, 李晓莉 1, 张世羊 1, 赵巧玲 1, 林玉良 1
收稿日期 : 20100608; 修订日期 : 20100823. 基 金 项 目 : 农 业 部 农 业 科 技 成 果 转 化 资 金 项 目 (2008GB23260394); 农 业 部 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 资 金 资 助 项 目 (NYCYTX-49); 中央级公益性科研院所基本科研业务费 ; 中国水产科学研究院渔业水体净化技术和系统研究重点 开放实验室开放基金项目 (FWT-200701) . 作者简介 : 姚延丹 (1984), 女 , 硕士研究生 . E-mail: fairy3558@ 通讯作者 : 李谷 , 研究员 . Tel: 0716-8126716; E-mail: ligu667@
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, 透明度 (SD) 用塞氏盘现场
测定。为便于分析 , P1 塘 6 月份样品编号为 S1-6, 7 月份为 S1-7, 前一数字代表塘号 , 后一数字代
第2期
姚延丹等 : 复合池塘循环水养殖系统微生物群落结构分析
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GGG GCG GGGGCA CGG GGGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′) 和 534R(5′-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3′), 扩增的 DNA 片 段为细菌的 16S rDNA 的 V3 区 , 同时设置阴性对 照。 PCR 的反应体系为 25μL, 其中包括 10×Buffer 2.5 μL, 10 mmol/L dNTP 0.3 μL, 10 mol/L 上下游 引物各 0.5 μL, 5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.3 μL, 50 ng/μL 模板 DNA 1.0 μL, 灭菌去离子水 19.9 μL。 使用美国 PTC-200 型 PCR 仪完成反应 , 整个过程 采用降落 PCR 模式 (touchdown-PCR, td-PCR)。程 序如下 : 94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 65 ℃ 退火 30 s, 72 ℃延伸 90 s, 之后每个循环退火温度 降低 0.5 ℃, 循环 20 次 , 在这个退火温度下再进 行 11 个循环 , 72 ℃最终延伸 5 min。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.4 DGGE 凝胶电泳 用扩增后的 PCR 产物进 行变性梯度凝胶电泳分析。所用的胶浓度为 10%( 丙烯酰胺 ׃双丙烯酰胺 =37.5:1, 质量比 ), 变 性梯度范围为 20%~50%(100%的变性剂中含有 7 mol/L 的尿素和 40%的去离子甲酰胺 ), 上样量为 20 μL 。运行状况是 : 在 1×TAE 电泳缓冲液 (20 mmol/L Tris+10 mmol/L 冰乙酸+0.5 mmol/L EDTA, pH 7.4)中 , 于 60℃, 80 V 条件下电泳 12 h。电泳 完成后 , 用银染的方法观察结果并照相保存。 所得图像 用 Bio-Rad 公司的凝胶 定量软件 Quantity one 4.1.0 进行处理 , 其中包括对泳道和 条带的技术处理及 DGGE 图谱的聚类分析。聚类 是依据戴斯系数(Dice Coefficient, Cs)按照 UPGMA 算法进行 , 其中 Cs=2j/(a+b), j 是样品 A 和 B 共有 的条带 , a 和 b 分别是样品 A 和 B 的条带数。戴 斯系数的范围是从 0(没有相同条带 )到 1(所有的 条带相同 )。 1.2.5 特征条带的回收与测序 从 DGGE 凝胶上 切下待回收条带的中间部分 , 放入 1.5 mL 的离心 管中 , 用枪头将凝胶压碎。 再加入 50 μL 的 TE 缓 冲液 , 于 4℃浸泡过夜。 次日 , 于 3 000 r/min 常温 下离心 1 min, 取 1 μL 上清液为模板 , 按照 1.2.3 中的 PCR 反应体系和程序再次扩增 , 用 DGGE 检 查回收条带的纯度和分离状况。如此重复 , 直到