海洋真菌多不饱和脂肪酸的快速检测
多不饱和脂肪酸
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市场上开发出的食用油产品系列，如： ☺ ω-6型油类：玉米油、花生油、芝麻油、葵花籽 油、红花籽油、麦胚油、葡萄籽油、琉璃苣油等 ☺ ω-3型油类：亚麻籽油、油菜籽油、核桃油、鱼 油等 形成功能性突出、脂肪酸配比合理、营养价值高 的食用油产品系列，既能满足人们对同常食用营 养的需求，又能提供特有的保健功能。
3 ω-6系列PUFA还可被头皮吸收，长效的非阻塞性保湿，增加头发 光泽
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三、PUFAs的提取方法 的提取方法
利用低温下不同的脂肪酸或脂肪酸盐在有机溶剂中溶解度不同来进行分离纯化。 利用吸附剂选择性吸附分离多不饱和脂肪酸，从而得到分离。
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邓宇峰利用微胶囊技术，以环糊精为主，明胶， 酪蛋白，卵磷脂多种材料为辅作为复合壁材，以 富含DHA，EPA等PUFAs的鱼油为芯材，采用喷 雾干燥法制成微胶囊，产品的流动性和溶解性良 好，在冰激凌、酸奶、威化饼干中应用，取得了 满意的效果。
多不饱和脂肪酸
汇报人：程超男 组 员： 梁文发 郑政东
Contents
一、PUFAs基本性质 二、PUFAs的生理功能 三、PUFAs的提取与分离 四、PUFAs的检测方法 五、PUFAs在食品工业中的应用 六、PUFAs的保护与安全性 七、PUFAs的研究进展
四、PUFAs的检测方法 的检测方法
将脂肪酸衍生成具有紫外吸收的物质后 用紫外检测器进行分析， 用紫外检测器进行分析，或衍生后采用 荧光法进行检测
分析技术具有分析速 度快、无化学污染、 度快、无化学污染、 无需复杂的样品处理 为检测器， 以MS为检测器 过程， 为检测器，得到 过程，特别适用于大 总离子流图和各组分 批量的样品检测 质谱图， 质谱图，经计算机检 索并与NIST标准质谱 近红外光谱 索并与 标准质谱 谱库的质谱数据匹配， 谱库的质谱数据匹配， 根据匹配度的大小和 脂肪酸气相色谱出峰 规律， 规律，鉴定各脂肪酸 组分。 组分。 液质联用
海洋保健食品 3 海洋生物活性物质
蛋白质类，如降钙素、鱼精蛋白、藻胆蛋白、 超氧化歧化酶SOD
糖蛋白类，如扇贝糖蛋白、牡蛎糖蛋白
活性小分子：
氨基酸类，如牛磺酸及其衍生物 多不饱和脂肪酸类，如DHA、EPA 萜类，如海兔素、藻类含卤倍半萜 色素类，如胡萝卜素、藻蓝蛋白、藻红蛋白 皂苷类，如海星皂苷、海参皂苷 生物碱类，如海绵和海鞘生物碱 多酚类，如褐藻多酚 微量元素类，如有机硒、有机碘
（2）防皱整理剂：壳聚糖的羟基和部分氨基与纤 维的羟基形成众多的分子间氢键，能起防皱效果， 制作特殊用途的布料。
（3）纺织整理剂：壳聚糖用作上浆料，使难上浆 材质易染色，对染料具有强亲和力，达到良好的 染色效果。
八、 膜材料
（1）反渗透膜：具有较高的脱盐率和透水率，还具 有强耐碱性，交链后的膜有耐酸性。 （2）渗透蒸发膜：用甲壳素制成的分离水和乙醇的 高性能功能分离膜，能耗低。 （3）仿生膜：壳聚糖制造的反渗析膜遇酸碱不易发 生化学变化，透水性好，是一种理想的人工肾用膜。 （4）超过滤膜：甲壳素制成的壳质膜，通过改变成 膜温度及用丙酮等有机溶剂浸处理，可调整分离膜的 强度及透过性能。
二、在保健领域中的应用
• 1 减肥降脂食品
2 降血压食品
• 3 血糖调节食品
4 免疫调节食品
• 5 胃溃疡防治食品
6 肠内菌群调节食品
• 7 肝脏机能强化食品 8 口腔保健食品
• 9 微量元素补充食品 10 重金属离子排除食品
1 减肥降脂食品
壳聚糖难被胃肠消化吸收，并可与自 身质量许多倍的甘油三酯、脂肪酸、 胆汁酸和胆固醇等脂类化合物生成络 合物，该络合物难被胃酸水解，难被 消化系统吸收，从而阻碍人体吸收， 使之排出体外。因此，壳聚糖类可以 降脂，减少食品热量。
3株海洋红酵母的分离及营养成分分析
3株海洋红酵母的分离及营养成分分析吴康;盛哲良;丁立建;何山;朱鹏;严小军;吴小凯【摘要】In order to explore marine red yeasts as the nutritional value of aquatic baits for isolation and analysis of nutritional compositions of red yeasts from sea mud and seawater around Dongji Island,China.The isolates were identified by the observation of the morphology and the analysis of ribosomas ITS sequences.The contents of fatty acids and amino acids were analyzed.Results showed that the strains RI21 and DONG17 were identified as Rhodotorula mucilaginosa,and DONG45 as Rhodosporidim paludigenum.The main fatty acids of the three marine red yeasts wereC16∶0,C18∶0,C18∶1 (n-9) and C18∶2 (n-6),and the total amino acid contents of the three strains RI21,DONG17,DONG45 was 346.9 mg/g,331.6 mg/g and 446.5 mg/g,respectively.The three strains possessed better fatty acid compositions and rich essential amino acids,and had a potential nutritional value as aquaculture feeds.%从东极岛海域海泥和海水中分离筛选海洋红酵母,对红酵母进行营养成分分析,旨在探讨红酵母作为水产饵料的营养价值.通过形态观察及ITS序列分析鉴定分离酵母菌株,并进行脂肪酸和氨基酸组成测定,评价其营养成分.结果表明:菌株RI21和DONG17被鉴定为海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),菌株DONG45被鉴定为红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum).3株海洋红酵母的脂肪酸主要组分为C16∶0、C18∶0、C18∶1(n-9)和C18∶2(n-6);总氨基酸含量:RI21为346.9mg/g,DONG17为331.6 mg/g,DONG45为446.5 mg/g.这3株红酵母具有优良的脂肪酸组成、丰富的必需氨基酸,有作为水产养殖饲料的潜在营养价值.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2017(038)012【总页数】5页(P2238-2242)【关键词】红酵母;分离鉴定;营养成分;脂肪酸;氨基酸【作者】吴康;盛哲良;丁立建;何山;朱鹏;严小军;吴小凯【作者单位】宁波大学/李达三海洋生物医药研究中心,浙江宁波 315211;宁波大学/李达三海洋生物医药研究中心,浙江宁波 315211;宁波大学/李达三海洋生物医药研究中心,浙江宁波 315211;宁波大学/李达三海洋生物医药研究中心,浙江宁波315211;宁波大学/李达三海洋生物医药研究中心,浙江宁波 315211;宁波大学/李达三海洋生物医药研究中心,浙江宁波 315211;宁波大学/李达三海洋生物医药研究中心,浙江宁波 315211【正文语种】中文【中图分类】Q934.1随着水产养殖业迅猛发展，同时也正面临着一些重大问题如抗生素的过度使用和饵料蛋白源不足等问题。
海洋微生物活性物质的研究进展
文章编号:1001-909X (2007)01-0055-11收稿日期:2005-03-14作者简介:刘晶晶(1982—),女,浙江衢州市人,硕士研究生,主要从事海洋生物学研究。
海洋微生物活性物质的研究进展刘晶晶,陈全震,曾江宁,高爱根,廖一波(国家海洋局第二海洋研究所,国家海洋局海洋生态系统与生物地球化学重点实验室,浙江杭州 310012)摘 要:海洋微生物由于其特殊的生存环境,往往能产生结构新颖、功能多样的活性物质,海洋微生物作为活性物质的新来源,正日益受到人们的关注。
综述了近几年海洋微生物产生的抗肿瘤、抗心血管病、免疫调节剂、抗生素等生物活性物质的开发利用现状及相关的研究技术和方法,展示出海洋微生物活性物质巨大的开发利用前景。
关键词:生物活性物质;微生物;海洋中图分类号:P 745 文献标识码:A 21世纪人类社会面临“人口剧增、资源匮乏、环境恶化”三大问题的严峻挑战,随着陆地资源的日趋减少,开发海洋,向海洋索取资源,尤其是海洋微生物资源将越来越受到人们关注。
海洋微生物为了适应特殊的生存环境,往往能产生不同结构和功能的天然活性物质,另外越来越多的实验证明,来自海洋动植物活性物质的真正生物源是海洋微生物[1]。
可见,海洋微生物活性物质的开发利用大有前途,目前这方面的研究进展迅速,人们已从放线菌、真菌、细菌、微藻等海洋微生物中分离出具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、免疫调节功能以及其它用途的生物活性物质。
这些物质是开发海洋药物的重要资源,并在化工、食品以及生命科学基础研究等领域都有着重要的应用价值。
1 海洋微生物活性物质的开发利用现状1.1 抗肿瘤的活性物质目前癌症是对人类威胁最大的疾病之一。
海洋微生物产生的活性物质种类丰富,结构多样,已成为寻找新的抗癌药物的一个最有希望的药源。
有学者预言,最有前途的抗肿瘤药物将来自海洋,而海洋微生物在此领域有着巨大的潜力[2]。
1.1.1 海洋放线菌海洋放线菌是一类特殊的、具有重要经济价值的微生物。
一种海洋真菌_裂殖壶菌的营养成分分析_朱路英
一种海洋真菌——裂殖壶菌的营养成分分析朱路英1,2，张学成2,*，王淑芳1，常林瑞1(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)摘 要：为评价海洋真菌裂殖壶菌的营养价值，测定该菌的基本营养成分、氨基酸组成及脂肪酸组成。
结果显示，在两种不同的氮源条件下，裂殖壶菌的总蛋白、总脂、总糖及灰分分别为9.35%、42.83%、5.27%、4.85%(豆粕水解物为氮源)和42.51%、18.98%、6.38%、5.72%(酵母提取物为氮源)。
以轮虫蛋白的必需氨基酸(EAA)为标准，裂殖壶菌的必需氨基酸指数EAAI ＞0.9，为轮虫的优质蛋白源，但精氨酸或异亮氨酸不能完全满足轮虫需要。
而以牡蛎蛋白的EAA 为标准，该菌的EAAI 为0.78～0.79，为牡蛎的可用蛋白源。
该菌中含有高水平的DHA ，含量可达14.29%，是一种优质的DHA 强化饵料。
另外，培养基中氮源种类的不同直接影响该菌的基本营养成分、氨基酸及脂肪酸组成。
关键词：裂殖壶菌；氨基酸组成；脂肪酸组成；营养价值Analysis of Nutritional Components of a Marine Fungus: Schizochytrium limaniumZHU Lu-ying 1,2，ZHANG Xue-cheng 2,*，WANG Shu-fang 1，CHANG Lin-rui 1(1. College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China ；2. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)Abstract ：In order to evaluate nutritional values of a marine fungus, Schizochytrium limanium , its basic nutritional components,amino acid and fatty acid compositions were analyzed. Results indicated that the contents of proteins, lipids, carbohydrates and ash in Schizochytrium limanium were 9.35%, 42.83%, 5.27% and 4.85% using soybean hydrolysates as nitrogen resource and 42.51%,18.98%, 6.38% and 5.72% using yeast as nitrogen resource, respectively. Using rotifer protein as the reference, essential amino acid index (EAAI) in Schizochytrium limanium were more than 0.90; using oyster protein as the reference, EAAI in Schizochytrium limanium were 0.78－0.79, which suggested that Schizochytrium limanium was the best quality protein material for rotifer and oyster. However, Schizochytrium limanium had limited amino acids such as Arg and Ile for rotifer. Totally 14.29% DHA was determined in Schizochytrium limanium , which also suggested it was a good DHA source. Moreover, nitrogen sources exhibited a direct effect on contents of nutritional components, amino acid and fatty acid compositions.Key words ：Schizochytrium limanium ；amino acid composition ；fatty acid composition ；nutritional value中图分类号：S963.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)24-0272-04收稿日期：2009-06-28基金项目：鲁东大学学科建设经费资助项目作者简介：朱路英(1974－)，女，讲师，博士，研究方向为生物化学。
海洋微藻高度不饱和脂肪酸的研究
黄鸿洲，董旭厦门大学生命科学学院（361005）piratehhz@摘要：高度不饱和脂肪酸在人和动物的生理活动中起着重要的作用，对人体心血管、神经、免疫系统疾病及癌症有一定的预防和治疗效果。
微藻中含有丰富的不饱和脂肪酸。
利用微藻培养PUFA是最有发展前途的研究方向。
本文对PUFA的生理功能，合成途径，合成影响因子以及利用海洋微藻生产PUFA的现状、优势和前景进行了讨论和总结。
关键词：微藻；高度不饱和脂肪酸(PUFA)；二十二碳六烯酸(DNA)；二十碳五烯酸(EPA)1．引言高度不饱和脂肪酸(PUFA)或其代谢产物不仅是构成高等动、植物细胞的重要成份之一，而且在人体内具有多种重要的生理功能，其中二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)被认为是比较重要的多不饱和脂肪酸。
EPA是具有5个双键的20碳化合物，DHA是具有6个双键的22碳化合物，双键的位置从碳链甲基端第三个碳原子开始，故称为，3(n-3)不饱和脂肪酸。
其结构如图1所示。
图1 EPA DHA结构示意图[1]传统上工业鱼油是EPA及DHA等多元不饱和脂肪酸的主要来源，尤其以深海鱼种中的含量较高，但是从鱼油中提取的多不饱和脂肪酸(PUFA)存在腥臭味，加工过程复杂，产品价格昂贵等问题，人们倾向与寻找新的PUFA的生产原料。
微藻蕴量丰富、种类繁多，在地球上大约存在30 000种不同门类的微藻。
近年来的研究表明，微藻中的不饱和脂肪酸含量丰富，越来越引起人们的重视，成为人们获取PUFA的重要来源。
2．PUFA的生理功能具有4-5个双键的高不饱和脂肪酸及其代谢产物不仅是构成动植物细胞膜结构的重要成分，而且具有多种重要的生理功能。
其中以EPA和DHA最为引人关注。
EPA和DHA可由亚麻酸转化合成，但在人体内脂肪酸的合成途径比较短，在体内没法直接合成EPA和DHA。
海洋环境中的有机污染物检测方法
海洋环境中的有机污染物检测方法随着海洋环境污染日益加剧，有机污染物的检测方法也越来越重要。
有机污染物广泛存在于海洋环境中，对人类健康和环境造成严重危害。
因此，发展高效、精确、安全、快速的有机污染物检测方法势在必行。
一、有机污染物的来源和种类有机污染物是指由碳、氢、氧、氮、硫、氯等元素构成的石油及其分解产物、农药、化肥、冷媒、塑料、橡胶、植物提取物等有机化合物在海洋环境中的残留物。
主要来源包括工业污染、农业生产、城市生活垃圾和海运事故等。
有机污染物种类繁多，例如多环芳烃（PAH）、有机卤素化合物（OCP）、挥发性有机物（VOCs）、酚类、臭氧破坏物等。
它们在海洋环境中的存在形式多样，通过化学反应和吸附作用，进入海洋食物链，导致生物体内的污染物积累和简化，引发生态环境问题，并在一定程度上影响海洋渔业资源的可持续性。
二、有机污染物检测的方法1.色谱法色谱法是当前较为常用的有机污染物分析方法之一。
它根据样品中物质在液态载体(油，脂肪，包括海藻、小型海洋动物)分子间的相互作用来选择性分离分析无数化合物的复杂混合物。
常用的色谱方法有气相色谱(GC)和液相色谱(LC)两种，也包括高效液相色谱(HPLC)，超级临界流体色谱(SFC)等方法。
色谱法具有灵敏度高、精度高、选择性强等优点，但同时还需要选择合适的前处理方法和标准样品，操作要求严谨，仪器设备高昂。
2.质谱法质谱法是一种基于分子的质量和分子结构信息进行分析的方法。
它可以与色谱法联用，形成各种色谱-质谱分析方法，常被用于有机污染物的快速分析、准确定量甚至质谱图库比对等。
质谱法能够检测出色谱法无法分离或难以识别和定量的复杂化合物，具有高分辨率、高检出灵敏度、结构分析准确等优点。
但与此同时，质谱法的操作方法及仪器设备也相对复杂。
3.免疫分析法免疫分析法是利用抗体结合有机污染物的特异部位实现检测的一种方法。
以酶连免疫吸附法(ELISA)和免疫细胞化学发光法(ICMA)为代表，免疫分析法具有灵敏度高、操作方便快速、资金投入较少等优点，但存在着影响因素多、可重复性差、抗体制备、抗原表达等方面的限制。
海洋微藻生物技术的研究现状与进展
海洋微藻生物技术的研究现状与进展王颖新生技0811 0820212132摘要：微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。
本文简要综述了海洋微藻生物培养技术的研究现状，并对其应用前景进行了展望，现代高新技术为海洋微藻的研究开发利用和产业化提供了更广阔的前景。
关键词：微藻、成分、培养技术、应用微藻是指一些微观的单细胞群体，是最低等的、自养的释氧植物。
它是低等植物中种类繁多、分布极其广泛的一个类群。
无论在海洋、淡水湖泊等水域，或在潮湿的土壤、树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方，微藻都能生存。
海洋微藻是海洋生态系统中的主要初级生产者 ,种类多 ,繁殖快 ,在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。
近几十年来 ,随着现代生物技术的应用 ,分离鉴定手段的提高 ,遗传工程、基因工程等的迅猛发展 ,人类对海洋微藻的研究开发已进入一个崭新的时期。
由于海洋微藻营养丰富 ,富含微量元素和各类生物活性物质 ,而且易于人工繁殖 ,生长速度快 ,繁殖周期短 ,所以在医药、食品工业、环境监测、生物技术、可再生能源等方面具有广阔的应用前景。
1微藻中的多种成分微藻种类繁多，微藻细胞中含有：蛋白质、脂类、藻多糖、β-胡萝卜素、多种无机元素（如Cu,Fe,Se,Mn,Zn等）等高价值的营养成分和化工原料。
微藻的蛋白质含量很高，是单细胞蛋白(SCP)的一个重要来源。
微藻所含的维生素A、维生素E、硫氨素、核黄素、吡多醇、维生素B12维生素C、生物素、肌醇、叶酸、泛酸钙和烟酸等增加了其作为SCP的价值。
藻中类胡萝卜素含量较高，具有着色和营养的作用，可用来防治癌症、抗辐射、延缓衰老,增强机体免疫力等生理作用。
化学合成均为反式的β-胡萝卜素，对人体有致癌、致畸的作用,而顺式异构体在抗癌、抗心血管疾病功能比全反式异构体高，藻粉中β-胡萝卜素含量高达14%。
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海洋真菌多不饱和脂肪酸的快速检测Ξ卞曙光 张晓昱 张 磊ΞΞ 黄开勋(华中理工大学化学系 武汉 430074)摘要:从海水中分离了一种产EPA和DHA的真菌,并建立了微生物油脂的快速提取、甲酯化及其多不饱和脂肪酸的含量的气相色谱测定方法。
结果表明:采用CHC l32KOH2CH3OH一步提取甲酯化适合于产多不饱和脂肪酸菌株的快速检测。
对其油脂的提取,采用湿菌丝魏氏盐酸水解法较为合适;并用KOH2 CH3OH法对所得油脂进行了甲酯化。
最后,运用毛细管气相色谱采用外标法测定了甲酯化样品中多不饱和脂肪酸的含量,其油脂中EPA和DHA的含量分别为7132%和7158%。
关键词:多不饱和脂肪酸,EPA,DHA,GC中图分类号:O657.71 文献标识码:A 文章编号:025322654(2001)012073204A FAST D ETER M INAT I ON OF POLY UNSATURATED FATT Y AC I D SPROD UCED B Y M AR INE FUNGUS3B I AN Shu2Guang ZHAN G X iao2Yu ZHAN G L ei33 HUAN G Kai2Xun(D ep t.of Che m istry,H uaz hong U niversity of S ei.&T ech.W uhan430074)Abstract:A fungu s that is capab le of p roducing EPA and DHA w as iso lated from seaw ater.A fast ex trac2 ti on and m ethyl esterificati on of m icrob ial li p id w ere estab lished as w ell as their con ten t determ inati on by cap illary gas ch rom atography u sing ex ternal calib rati on m ethod.T he resu lts show ed that the m ethyl ester p repared directly fo rm the w et m ycelia treated w ith CHC l32KOH2CH3OH is less ti m e2con sum ing and the m ethod fits fo r the fast determ inati on.To determ ine its EPA and DHA con ten t,the w et m ycelia w as hy2 dro lyzed acco rding to W eibu l’s m ethod and the li p id ob tained w as m ethyl esterified w ith KOH2M eOH,the resu lts ob tained by cap illary gas ch rom atography u sing ex ternal calib rati on m ethod w ere7.32%and7.58%respectively.Key words:Po lyun satu rated fatty acids,E ico sapen taeno ic acid,Doco sahexaeno ic acid,Gas ch rom atogra2 phy 多不饱和脂肪酸(PU FA)是指含有两个或两个以上双键,碳链数在16～22的直链脂肪酸。
目前,受到人们普遍关注的主要有Χ2亚麻酸(GLA),二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)[1]。
研究表明,GLA、EPA具有降血脂、降血糖、抗血栓、抗炎、抑制血小板凝聚的功能;而DHA则具有健脑、促进大脑发育,防止老年性痴呆及抗心血管疾病的作用。
[2]。
但由于人类及其它哺乳类动物缺乏△9以上的减饱和酶,故它们在体内不能合成,只能从饮食中摄取。
通常,这些武汉市科委基金资助项目(N o.996001019G)ΞΞΞ现在武汉华中理工大学环境科学与工程系收稿日期:1999211217, 修回日期:2000201205PU FA s仅存在于某些深海鱼及某些动植物体内,由于受资源的限制,其产量不能满足人们的需求,而研究表明,某些低等海洋真菌具有合成PU FA的能力[3,4],且微生物培养具有发酵周期快,不受条件限制等优点,故成为近年来人们研究的热点。
本文从海水中分离了一种产EPA和DHA的真菌,并运用H P26890毛细管气相色谱对其含量进行了测定。
1 材料与方法1.1 水样来源中国南海水样加以芝麻、瓜子、亚麻子、花生、黄豆、核桃仁并于28℃富集60d得到各分离水样。
1.2 试剂及仪器1.2.1 PU FA甲酯标准品:GLA甲酯,EPA甲酯及DHA甲酯购自Sigm a公司,标准品以精制苯作溶剂配制标准溶液。
注射用硫酸链霉素:华北制药股份有限公司。
其它试剂均为分析纯。
11212 气相色谱仪:惠普H P26890;F I D检测器;H P3398A GC Chem stati on积分仪;H P2I N2 NOW A X(C ro sslinked Po lyethylene Glyco l)毛细管柱:30m×0.25mm×0.25Λm。
HQL1502B大振幅恒温摇床:中国科学院武汉科学仪器厂。
113 培养基分离用培养基M l:N aC I30g,KC l1g,KH2PO41g,(N H4)2SO40.2g,N aHCO30.1g,可溶性淀粉25g,酵母浸出汁2g,琼脂20g,H2O1000mL。
分离用培养基M2:可溶性淀粉10g,葡萄糖10g,酵母浸出汁10g,花生油5g,琼脂20g, H2O1000mL。
以上培养基经灭菌后冷却至50℃～60℃后按下法加入注射用硫酸链霉素以抑菌:取国产0.5g 装链霉素(100万单位)注入无菌水5mL,溶解后取1.0mL于330mL无菌水中,按10%用量加入到上述M1,M2培养基中,并倒成平皿培养基。
液体培养基:20%土豆浸出汁,2%蔗糖。
114 海洋微生物的分离及培养将各富集水样分别以10-1,10-2,10-3,10-4,10-5稀释度接至M1,M2培养基上,于28℃生长,不断分离和纯化单菌落,直至得到纯种。
经12.5×40倍生物显微镜观察,选取含脂肪颗粒大而密的菌种。
将分离得到的菌种接至100mL土豆培养基中,于150r m in,28℃下培养48h,20℃24h,15℃24h,并于0℃～5℃下冬化24h。
菌丝收获后抽滤,并用蒸馏水冲洗3遍。
115 产PUFA的菌株的气相色谱定性检测11511 样品的甲酯化(CHC l32KO H2CH3O H直接酯化法):取抽干的湿菌丝1g于具塞试管中,加入4mL CHC l3和2mL0.5m o l L KO H2CH3O H,剧烈震荡2m in,并于50℃水浴保持10m in(充N2保护),剧烈震荡2m in,加入3.6mL双蒸水,再剧烈震荡1m in。
过滤,静置分层,取下层CHC l3层分析。
11512 气相色谱分离条件:对脂肪酸甲酯的分离,在H P26890上采用二阶程序升温法:150℃△=15℃ m in200℃(持续15m in)△=2℃ m in240℃(持续2m in)。
进样口温度260℃,检测器温度260℃。
H2流速:30mL m in,空气流速:150mL m in,N2流速:30mL m in,柱流速:1mL m in(常流),尾吹:29mL m in,分流比100∶1,进样量1ΛL。
2 结果211 海洋真菌PUFA 的气相色谱鉴定图1(a ),(b )分别为GLA 、EPA 、DHA 甲酯标准品和南海M 1核1022号菌株样品的气相色谱图谱。
可以看出,南海水样通过核桃仁富集后以1022稀释度所分离得到的菌丝中含有EPA 及DHA。
图1(a ) GLA 和DHA 甲酯标准品气相色谱图谱图1(b ) 分离菌株甲酯样品的气相色谱图谱212 不同提取方法对油脂得率的影响先将抽干的湿菌丝于250℃,10～20Pa 冷冻干燥至恒重并研磨,对所得的菌丝按以下方法抽提:(A )于Soxh let 脂肪提取器中以CHC l 3 CH 3O H (2∶1)回流提取24h ;(B )以石油醚(bp ∶30℃～60℃)回流提取24h ;(C )以无水乙醚回流提取24h ;(D )魏氏盐酸水解法[5]水解后以石油醚萃取;(E )直接取含水量约80%的湿菌丝以魏氏盐水解法提取。
各所得提取液以N 2吹干,并计算油脂图2 不同提取方法对油脂得率的影响A 、B 、C 、D 、E 菌株的不同提取方法得率。
所得结果见图2。
干菌丝以氯仿 甲醇(2∶1)提取,虽得率较高,所得油脂主要为棕色的固体油渣,而非流动状的油脂,因而杂质较多;而以石油醚或乙醚提取,油脂提取率较低;干菌丝魏氏水解法由于其水解过程较为剧烈而使菌丝水解后颜色明显变黑。
由于多不饱和脂肪酸很容易被氧化,故油脂中多不饱和脂肪酸有可能被氧化;而以含水量较高的湿菌丝魏氏水解法水解则在很大程度上避免了其氧化,且菌丝无需干燥,操作时间短,适合于含多不饱和脂肪酸的油脂的快速提取。
213 菌丝油脂中多不饱和脂肪酸含量的气相色谱测定取M 1核1022号分离菌株湿菌丝以魏氏盐酸水解法所得油脂30～100m g 于25mL 具塞试管中,加入2mL 石油醚(bp ∶30℃～60℃) 苯(1∶1,v v )混合试剂,轻摇使溶解后加入2mL 0.5m o l L KO H 2CH 3O H 于室温酯化10～15m in 以后水洗,静置分层后取上层有机层进样分析。
分别以GLA 甲酯,EPA 甲酯及DHA 甲酯标准溶液的气相色谱峰面积对其浓度(Λg mL )作图。
表1为3种脂肪酸甲酯标准品的线性回归结果。
从线性回归结果来看,线性关系较好,线性范围为(50～2000由标准曲线计算的油脂中EPA 和DHA 含量分别为:(7.32±0.25)%和(7.58±0.30)%,(n =3)。
表1 脂肪酸甲酯标准品的线性回归结果标准品线性回归方程相关系数r GLA 甲酯Y =-52253.15+1074.00x 0.9984EPA 甲酯Y =14887.36+1800.28x 0.996DHA 甲酯Y =-13980.48+1428.69x 0.99873 讨论在对产多不饱和脂肪酸的菌株分离和筛选过程中,菌丝的充分干燥,油脂的提取将是一个很大的工作量。