基因工程的基本工具
人教版生物选修三1.1基因工程的基本工具
思考：
不同的DNA分子用同一种限制酶切割产生的 黏性末端是否都相同？ 相同
同一DNA分子用不同的限制酶切割产生的黏
性末端是否相同？
不一定
将一个基因从DNA分子中切割下来，需要几 个限制酶，同时产生几个黏性末端？
2
4
二、 DNA连接酶——“分子缝合针”
1、种类： E·coli DNA连接酶（黏性末端） T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端）
2、作用部位：磷酸二酯键
三、载体——“分子运输车”
1、载体的作用 将 目的基因 转移到受体细胞中去。
2、常用的载体 质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
3、作为载体必须具备的5个条件
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
2）有一个至多个限制酶切割位点，以便与外源基因 连接。
3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 4）必须是安全的 ，对受体细胞无害。 5）载体DNA 分子应大小适中，以便于提取和操作
终止子
AGGTCACGTCG TCCAGT TCCAGTGCAGC AGGTCA
A G G U C A C G U C G RNA聚合酶
mRNA
RNA聚合酶
多肽链
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区
外显子
非编码区
启动子
与RNA聚合酶 结合位点
内含子
终止子
真核 细胞 的 基因 结构
编码区 间隔的、不连
续的
外显子 内含子
非编码区
不能编码蛋白质的区段，调 控遗传信息的表达
非编RNA聚合酶 结合位点
mRNA前体
1
2
34
5
外显子
内含子
转录
1
基因工程的基本工具
议
判断：1.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2.质粒上有细菌生活所必需的全部基因 3.没有限制酶就无法使用质粒运载体 4.质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的 5.质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行 6.质粒必须具有抗生素基因以便筛选 7.质粒是独立于细菌拟核DNA之外的双链DNA分子，不与蛋白质结合 8.质粒是存在于拟核中能够自主复制的小型环状DNA分子 9.载体能够在受体细胞中进行自我复制，但不能整合到染色体DNA上 10.运载体具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 11.运载体具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合 12.细菌的质粒、棉花的拟核、动植物病毒都可作为基因工程的载体 13.抗性基因可用于检测目的基因是否表达 14.抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达 15.DNA连接酶只能连接两个末端具有互补碱基的DNA分子片段 16.DNA连接酶可连接双链的氢键,使双链延伸 17.DNA连接酶、解旋酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键 18.相同的黏性末端能够按照碱基互补配对的原则通过氢键相连接，但这个过 程必须在DNA连接酶的催化条件下进行
自由展示
展
3.7对
判断：1.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2.质粒上有细菌生活所必需的全部基因 3.没有限制酶就无法使用质粒运载体 4.质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的 5.质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行 6.质粒必须具有抗生素基因以便筛选 7.质粒是独立于细菌拟核DNA之外的双链DNA分子，不与蛋白质结合 8.质粒是存在于拟核中能够自主复制的小型环状DNA分子 9.载体能够在受体细胞中进行自我复制，但不能整合到染色体DNA上 10.运载体具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 11.运载体具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合 12.细菌的质粒、棉花的拟核、动植物病毒都可作为基因工程的载体 13.抗性基因可用于检测目的基因是否表达 14.抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达 15.DNA连接酶只能连接两个末端具有互补碱基的DNA分子片段 16.DNA连接酶可连接双链的氢键,使双链延伸 17.DNA连接酶、解旋酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键 18.相同的黏性末端能够按照碱基互补配对的原则通过氢键相连接，但这个过 程必须在DNA连接酶的催化条件下进行
《基因工程的基本工具》 作业设计方案
《基因工程的基本工具》作业设计方案一、作业目标1、帮助学生深入理解基因工程中三种基本工具（限制性内切酶、DNA 连接酶、运载体）的作用和特点。
2、培养学生运用所学知识解决实际问题的能力。
3、增强学生对基因工程技术的兴趣，激发其探索科学的热情。
二、作业内容1、知识梳理（1）让学生总结限制性内切酶的来源、作用部位、作用特点，并举例说明其在基因工程中的应用。
（2）要求学生阐述 DNA 连接酶的种类、作用部位和作用结果，比较不同种类 DNA 连接酶的异同。
（3）使学生明确运载体的种类、具备的条件以及常见的运载体有哪些。
2、案例分析提供一些基因工程的实际案例，如利用基因工程生产胰岛素、转基因抗虫棉等，让学生分析在这些案例中基本工具是如何发挥作用的。
3、实践操作（1）给定一段含有特定序列的 DNA 片段，要求学生模拟限制性内切酶的切割过程，并画出切割后的结果。
（2）给出两段已被限制性内切酶切割的 DNA 片段，让学生尝试用DNA 连接酶将它们连接起来，并写出连接后的序列。
4、拓展思考（1）假如没有限制性内切酶，基因工程还能实现吗？为什么？（2）随着科技的发展，未来可能会出现哪些新型的基因工程工具？三、作业形式1、书面作业（1）完成知识梳理部分的内容，以填空、简答的形式呈现。
（2）针对案例分析，撰写一份详细的分析报告。
2、实践作业（1）在纸上完成模拟切割和连接的过程，并拍照上传。
（2）通过网络搜索或阅读相关资料，回答拓展思考的问题，并以文档形式提交。
四、作业难度作业难度分为基础、提高和拓展三个层次。
1、基础层次主要涵盖知识梳理部分的内容，让学生对基本工具的概念和作用有初步的了解。
2、提高层次包括案例分析和实践操作中的部分内容，需要学生运用所学知识进行分析和操作。
3、拓展层次涉及拓展思考部分，鼓励学生发挥想象力和创新思维，探索基因工程的未来发展。
五、作业时间本次作业预计总时长为一周。
1、知识梳理和书面作业：2 3 天。
新教材高中生物第3章基因工程 基因工程的基本工具与聚合酶链式反应PCR技术教师用书苏教版选择性必修3
第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。
科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。
社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。
↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。
史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。
↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。
↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。
↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。
↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。
二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。
(2)原理：基因重组。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
基因工程的基本工具(A)
基因工程的基本工具（A）［知识梳理］实现这一精确的操作过程至少需要三种工具即准确切割DNA的“手术刀”——限制性核酸内切酶、将DNA片段再连接起来的“缝合针”——DNA连接酶、将体外重组好的DNA导入受体细胞的“运输工具”——（运）载体（一）、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1、又称限制酶或（限制性内切酶）2、主要是从原核生物中分离纯化出来的是原核生物的防御机制) 3*、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，（大多数限制酶识别序列6个核苷酸组成）并在特定的切点（两个核苷酸之间的磷酸二酯键）上切割DNA分子（体现酶的专一性；注意与解旋酶的区别）4、切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——错位切：产生黏性末端。
平切：产生平口末端。
例：1）GAA TTC(写出)CTTAAG2) CCCGGGGGGCCC(二)DNA连接酶——“分子缝合针”1、两种来源不同的DNA用同种限制酶切割后，末端可以相互黏合，这种只能使互补的碱基连接起来，脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口（磷酸二酯键），需要靠DNA连接酶来“缝合”。
2、根据酶的来源不同，可以将这些分为两类：一类：从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coliDNA连接酶；只能将双链DNA另一类；从T4噬菌体中分离出来的，称T4DNA连接酶；既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
（三）基因进入受体细胞的（运）载体——“分子运输车”1、通常利用质粒，质粒存在于许多细菌以及酶母菌等生物中。
质粒是独立于细菌（细胞）染色体外（即拟核DNA）之外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
质粒上有决定固氮、抗药性、抗生素生成的基因（可作为标记基因）。
2、作为运载体的特点：1）、有一个到多个限制酶的切割位点；(供外源DNA片段(基因)插入其中)2）、能进行自我复制；(在细胞中自称复制，或整合到染色体DNA上，随染色体进行同步复制)。
高中生物基因工程基本工具
基因工程
又名DNA重组技术，包括体外DNA重组及转基因等技术
（体外DNA重组技术主要用于基因表达载体的构建，
转基因技术主要用于将目的基因导入受体细胞）
特点：在体外进行的人为的，在DNA分子水平的基因重组，成功后可遗传后代
基本工具：
1.分子手术刀（限制酶）
来源：主要是从原核生物体内分离纯化出来的
作用特点：专一性，可特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使特定部位的两个核苷酸间的磷酸二酯键断开
产生结果类型：黏性末端和平末端（粘性末端可依靠氢键，即分别位于两条链上的两个脱氧核苷酸的含氮碱基之间形成的相互作用，进行特异性黏合）识别序列特点：专一性，回文序列，一般为六个，少数有4、5或8个（回文序列指中心轴线两侧的双链DNA上的碱基反相对称重复排列）
2.分子缝合针（DNA连接酶）
作用位点：催化合成磷酸二酯键
注：可作用于磷酸二酯键的酶有：限制酶（断开作用），DNA连接酶和DNA聚合酶
（催化合成作用）
可作用于氢键的酶只有解旋酶（断开作用），氢键的合成不需要酶催化
3.分子运输车（载体）
常用载体：质粒（多数细菌、酵母菌中含有，最常用的载体），λ噬菌体的衍生物，动植物病毒
功能：将目的基因转运到宿主细胞内，并对目的基因进行大量复制
条件：①对受体细胞无毒害
②在宿主细胞中能保存并大量复制
③有多个限制酶切割位点，便于插入
④有标记基因，便于筛选。
2024届高考一轮复习生物课件(人教版)：基因工程的基本工具和基本操作程序
4.目的基因的检测与鉴定
拓展 提升科学思维
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各 种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在 该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题： (1)什么是引物？ 提示 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 (2)PCR技术为什么需要引物？ 提示 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。
拓展 提升科学思维
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA
片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是
，限制性内切
核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是
，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形 成黏性末端的过程。
提示 限制性内切核酸酶Ⅰ： 限制性内切核酸酶Ⅱ：
本质
DNA
DNA
mRNA
mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
RNA聚合酶识 别和结合的部 功能 位，驱动基因 转录出mRNA
翻译的起始 使转录在所需要
信号(编码氨 的地方停下来
基酸)
翻译的结束信 号(不编码氨 基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法 农杆菌转化法、花__粉__管__通__道__法__ 显微注射法 Ca2＋ 处理法
(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？ 第n轮循环需要消耗多少个引物数？ 提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗 的引物数为2n个。
高一生物基因工程生物技术的安全性和伦理问题试题答案及解析
高一生物基因工程生物技术的安全性和伦理问题试题答案及解析1.下列不属于基因工程最基本工具的是( )A．限制酶B．mRNA C．DNA 连接酶D．运载体【答案】B【解析】基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶和运载体，故ACD正确，B错。
【考点】本题主要考查基因工程的工具，意在考查考生能理解所学知识的要点的能力。
2.下列基因工程的操作顺序，正确的一组是()①目的基因的表达和检测②目的基因与运载体结合③将目的基因导入受体细胞④目的基因的提取A．①②③④B．④③②①C．④②③①D．②③④①【答案】C【解析】基因工程的步骤包括：获取目的基因、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定，故C正确。
【考点】本题主要考查基因工程步骤，意在考查考生能理解所学知识的要点的能力。
3.斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。
具体纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。
利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。
未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。
用个体M和N进行如下杂交实验⑴在上述转基因实验中，将G基因与质粒重组，需要的两类酶是和。
将重组质粒显微注射到斑马鱼受精卵中,整合到染色体上的G基因表达后，使胚胎发出绿色荧光。
根据上述杂交实验推测：⑵M的基因型是（选填选项前的符号）a. DDGGb. DDggc. Ddggd. DdGg⑶杂交后，出现红·绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代（填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的__________发生了交换，导致染色体上的基因重组。
【答案】⑴限制性核酸内切酶 DNA连接酶选择性⑵ C ⑶N 非姐妹染色单体【解析】（1）基因工程操作过程中需要两类工具酶：限制性核酸内切酶DNA连接酶。
动物细胞工程的受体细胞一般是受精卵。
（2）根据性状可以判断亲本的基因型是D_gg和D_ G_，因为子代出现了绿色荧光（D_G_）和红色荧光（ddgg）的子代胚胎，则亲代M中必定均含有d基因，同时可推出M的基因型是：Ddgg。
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海淀实验中学 张可文
红色荧光蛋白
基因表达
红色荧光蛋白基因
概念： 概念：
目的基因
转基因生物
把一种生物的基因转入另一种生物体 把一种生物的基因转入另一种生物体 基因转入另一种 使其产生我们需要的基因产物 基因产物， 中， 使其产生我们需要的基因产物，或让 它获得新的遗传性状 遗传性状， 它获得新的遗传性状，定向改造生物的新 技术。 技术。
限制性内切酶对抗外来DNA 限制性内切酶对抗外来
细菌的自我保护系统 病毒 细菌细胞 病毒DNA 病毒
限制性内 切酶
切
割
病毒注入DNA 病毒注入 分子
限制性内切酶切割入 侵的DNA 侵的
限制性内切酶 DNA
DNA片断 片断
磷酸二酯键
氢键
部分限制性内切酶识别序列
限制酶名称 识别序列 AGCT TCGA ^ GGGCCC CCCGGG ^ GGATCC CCTAGG ^ GAATTC CTTAAG ^ AAGCTT TTCGAA ^ ^ ^ ^ ^ ^ 限制酶名称
标记基因
自主复制 pBR322质粒结构 质粒结构
进行筛选
如果外源DNA 如果外源 插入， 插入，氨卞青霉 素抗性基因失活
含四环素
含氨卞青霉素
含四环素
操 作
A品系大肠杆菌 品系大肠杆菌
B品系大肠杆菌 品系大肠杆菌
• 1968年，两位科学家从B品系大肠杆菌中发 年 两位科学家从 品系大肠杆菌中发 现一种酶----可识别特定的脱氧核苷酸序列， 特定的脱氧核苷酸序列 现一种酶 可识别特定的脱氧核苷酸序列， 切割外源DNA分子。 分子。 并切割外源 分子 • 推测这种酶对于大肠杆菌有何作用？ 推测这种酶对于大肠杆菌有何作用？
回文序列
识别序列 GCGGCCGC CGCCGGCG ^ GAGCTC CTCGAG ^ GTCGAC CAGCTG ^ CCCGGG GGGCCC ^ TCTAGA AGATCT ^ ^ ^ ^ ^ ^
AluI ApaI BamHI EcoRI HindIII
NotI SacI SalI SmaI XbaI
DNA
AA G C T T T T C G AA
6 出现概率：1/4
DNA
A
B
A AGCTT TTCGA A
C
D
迄今已从近300种微生物中分离出了约 种微生物中分离出了约4000种限制酶。 种限制酶。 迄今已从近 种微生物中分离出了约 种限制酶
各种型号“剪刀” 各种型号“剪刀” 限制性内切酶
1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA 年 世界上有五个实验室几乎同时发现了 连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。 裂口的修复。 连接酶，这种酶能够参与 裂口的修复
目的基因
运载体
受体细胞
问：运载体具备什么特点才能完成此操作？
运载体的特点1： 运载体的特点 ： 能进入并在宿主细胞内稳定保存并大量复制； 能进入并在宿主细胞内稳定保存并大量复制； 复制 自然界生物可以将自身的遗传物质注入 其他生物体内， 其他生物体内，并进行复制表达？ 常用的运载体：质粒、 常用的运载体：质粒、病毒
DNA连接酶 DNA连接酶
连接的部位： 连接的部位： 磷酸二酯键
下列片断在DNA连接酶的作用下能 下列片断在 连接酶的作用下能 连接起来吗？ 连接起来吗？
• • • 平末端与平末端 √ × 平末端与粘性末端 粘性末端与粘性末端
不一定， 不一定，相同的粘性末端可以连接
？
基因很难进入受体细胞中，即 使进入也不能进行复制和表达
2
运载体
PStⅠ
G CTTAA CTTAA G
PSt Ⅰ
G CTTAA CTTAA G
目的基因所在片段
DNA连接酶 连接酶
重体的特点3： 运载体的特点 ：有标记基因
PStⅠ
外源基因连接
PStⅠ
限制性内切酶 识别序列
如果外源 DNA插入， 插入， 插入 氨卞青霉素 抗性基因失 活
HindⅡ Ⅱ GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ Ⅰ GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平末端
黏性末端
回文序列： 回文序列：一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的 顺序完全一致
EcoRI） （EcoRI）
HindⅢ切割位点 Ⅲ
细菌的质粒：自主复制的双链、闭合、 细菌的质粒：自主复制的双链、闭合、 双链 环状DNA分子； 分子； 环状 分子 可以在细胞间转移
相 同 限 制 酶
G CTTAA
……
CTTAA G
重 组 质 粒
DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA 连 接 酶
？
G CTTAA 目的基因 CTTAA G
DNA
“剪刀” 剪刀” 剪刀
“运载体” 运载体” 运载体
“针线” 针线” 针线
20世纪 年代，相继有两个实验室在研究噬菌体宿主 世纪50年代 世纪 年代， 范围时发现： 范围时发现：
噬菌体寄生于天然宿主A品系的大肠杆菌 噬菌体寄生于天然宿主 品系的大肠杆菌 • 1962年，arber发现，噬菌体 发现， 年 发现 噬菌体DNA在B品系 在 品系 将噬菌体转移于B品系大肠杆菌时不能繁殖 将噬菌体转移于 品系大肠杆菌时不能繁殖 被切割成片段（ 中，DNA被切割成片段（降解） 被切割成片段 降解）