实验9 PCR产物回收
PCR产物回收 酶切鉴定
PCR产物回收酶切鉴定pcr产物回收酶切鉴定pcr产物回收.酶切鉴定pcr产物废旧、酶乌鉴别1.1实验目的1.掌控pcr产物废旧和酶乌鉴别的基本原理2.熟悉pcr产物回收和酶切鉴定的具体操作过程3.鉴别β-珠蛋白基因（β-gbobingene）多态性1.2实验原理1.2.1pcr产物废旧实验原理pcr产物一般都含有过量的引物、taqdna酶及dntp，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧pcr测序反应等过程，因此有必要除去。
目前核酸纯化的方法有很多，回收试剂盒的出现使dna的纯化过程变得更加简便、快捷。
试剂盒pcr废旧原理：试剂盒中废旧管内所带的硅基质膜，具备在低盐、高ph值情况下溶解dna，高盐、低ph值情况下释放出来dna的性质。
1.2.2酶切实验原理限制性内乌酶：生物体内能辨识并研磨如上所述的双链dna序列的一种内乌核酸酶。
β-珠蛋白基因pcr产物中所含avaⅱ酶切位点，可以被avaⅱ酶研磨。
1.3方法步骤1.3.1pcr产物提纯操作步驟1.将pcr反应产物移至干净的1.5ml离心管。
2.重新加入3倍体积的bindingsolution至反应产物溶液(50μl的pcr溶液，加入150μl的bindingsolution并振荡混合均匀）3.将spincolumn放进collectiontube中，将反应溶液放进spincolumn中，以12,000×gVergt1分钟，弃置collectiontube中的液体。
4.加入700μl的washsolution，于12,000×g离心1分钟。
丢弃废液,重复此步驟一次。
5.弃置废液，12,000×gVergt除去残存的酒精。
6.将spincolumn转移至新的1.5ml离心管(microcentrifugetube)并加入30μl的elutionsolution或h2o(ph7.0~8.5)至column，静置2分钟。
PCR基因扩增及扩增产物的回收
新一轮循环
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA
PCR的特点
特异性强：① 特异的DNA引物。 ② 高温下进行延伸 敏感性高: 理论上只要一条模板链， 32次循环就可合成约109条！ 快 简 速:整个PCR过程约2～4小时 便:对模板的纯度要求低 模板种类多样化
PCR反应的影响因素
PCR反应的条件优化
变性温度和时间：92-95℃，富含G和C的序列，可适 当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失； 退火温度与时间：引物中G、C含量高、•长度长并与 模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异
性越高，通常37-55℃、1-2分钟；
延伸温度和时间：72℃，接近Taq酶的最适75℃；延 伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的 目的序列，则可适当增加时间； 循环次数：循环过多，非特异性产物大量增加
•Vent DNA聚合酶： 有3‘5’外切酶活性，
能耐受100oC高温。
•Pfu DNA聚合酶：
有3‘5’外切酶活性，是目前已发 现的所有耐高温DNA 聚合酶中出 错率最低的
Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物 •Taq Plus DNA聚合酶：
Taq的PCR产物3’端往往带有一个A
基因工程原理（吴乃虎） 分子克隆实验指南（第三版）
PCR技术原理
• 高温变性
• 低温复性（退火） • 适温延伸
•适度循环
DNA模板高温变性:
双链DNA在受热后，配对碱基
的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
模板（template）
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
95oC
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。
【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。
pcr切胶回收的步骤
pcr切胶回收的步骤
PCR切胶回收呀，这可是个很有趣的小实验呢。
先说说准备工作吧。
你得有已经跑过PCR并且经过琼脂糖凝胶电泳的胶块哦。
然后呢，把要用的工具都准备好，像干净的刀片啦，还有专门的切胶回收试剂盒。
开始切胶啦。
在紫外灯下看胶块的时候，就像寻宝一样呢。
找到你要的那条DNA 条带，然后用刀片小心翼翼地把它周围的胶切下来。
可别切太大块啦，不然会有好多杂质的。
切的时候就像在给小宝贝做精细的手术一样，要很小心哦。
切好胶之后，就按照试剂盒的说明来操作啦。
一般是把切下来的胶放到一个离心管里，然后加入一些溶液，让胶融化。
这时候你就看着胶慢慢变成液体，感觉就像魔法一样呢。
接着呢，要把融化后的液体加到吸附柱里。
这个吸附柱就像一个小卫士，专门把DNA吸附住，而那些杂质就被留在外面啦。
把液体加进去之后，离心一下，就像坐小过山车一样，让液体在离心力的作用下快速通过吸附柱。
然后呢，要清洗一下吸附柱。
这一步就像是给小卫士洗个澡，把它身上可能残留的杂质都洗干净。
再离心一下，把清洗的液体甩掉。
最后就是把我们想要的DNA从吸附柱上洗脱下来啦。
加入洗脱液，再离心，这个时候我们的DNA就乖乖地跑到洗脱液里啦。
就像把小宝贝从保护它的小房子里接出来一样。
这样，PCR切胶回收就完成啦。
虽然过程有点小复杂，但是只要按照步骤来，就可以得到我们想要的纯净的DNA啦。
每次做这个实验都感觉像是在和小小的DNA分子玩一场有趣的游戏呢。
pcr产物回收方法
pcr产物回收方法嘿，咱今儿就来说说这 PCR 产物回收的事儿！你可别小瞧了这一步，就好像是在一堆宝贝里挑出最闪亮的那颗宝石呢！首先呢，咱得准备好工具，就像战士上战场得有趁手的兵器一样。
这其中凝胶回收试剂盒那可是必不可少的呀！然后呢，就是把含有 PCR 产物的凝胶切下来。
这可得小心点儿，别把咱想要的宝贝给弄丢了或者弄破了。
你想想，这就好比是从一个大蛋糕上切下一块你最喜欢的口味，得稳稳当当的呀！切下来后，把它放到离心管里，就像是给宝贝找了个小窝。
接下来加入一些溶液，让它和凝胶好好地融合一下，把产物给释放出来。
这过程就好像是给宝贝洗个舒服的澡，让它干干净净地出来。
之后呢，离心一下，让那些不需要的杂质都沉淀下去，咱要的产物就乖乖地浮在上面啦。
这感觉就像把沙子和金子分开一样，留下的都是精华呀！再然后，把上清液转移到另一个管子里，这里面可都是咱辛辛苦苦要回收的宝贝呀。
这时候，你不觉得特别有成就感吗？就好像经过千辛万苦终于找到了宝藏一样。
接着，又加入一些试剂，让产物更好地结合在一起，变得更纯更干净。
这就像是给宝贝穿上了一件漂亮的衣服，让它更加耀眼。
最后，再离心一次，把产物沉淀下来，洗一洗，晾干。
哇哦，咱的PCR 产物就回收好啦！这感觉，就像是精心培育的花朵终于绽放了一样让人开心。
你说，这 PCR 产物回收是不是很有趣呀？虽然过程有点繁琐，但当你看到那纯净的产物时，一切都值得啦！它可是后续很多实验的重要基础呢，可不能马虎对待呀！所以呀，咱得认真仔细地做好每一步，就像呵护一个小生命一样。
你说是不是这个理儿呢？咱可不能因为一点小疏忽就前功尽弃呀，那多可惜呀！所以，加油吧，让我们在 PCR产物回收的道路上越走越稳，收获满满的成果！。
PCR产物回收实验
缺点
• 损失DNA，特别是高分子量DNA与极低分子 量DNA。
PCR产物回收步骤
• 回收过程：结合—洗涤—洗脱
• 具体步骤：参照试剂盒说明书
PCR产物酶切
• 目的：鉴定β-Gbobin gene 多态性 • 限制性内切酶：Avr II和BamH I • 温度：控制在37 ℃,2-4小时，不要超过16小 时。 • 注意：每一种酶都有特有的Buffer，不能混 用。
Th
• DNA片断的分离与回收是基因工程操作中的 一项重要技术，例如可收集特定酶切片断 用于克隆或制备探针，回收 PCR产物用于再 次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术 指标是纯度和回收率：前者未达标时会严 重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与 的反应；后者不理想时 往往会大大增加前 期的工作量。
验证gbobingene多态性pcr产物pcr产物回收dna片断的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术例如可收集特定酶切片断用于克隆或制备探针回收pcr产物用于再次鉴定等
β-Globin gene (β-Gb)多态性分析 ----PCR产物回收，酶切
孟宪超 方晓云 吴勰
实验目的及背景
• DNA序列多态性：基因组DNA核苷酸序列在 不同个体间最本质的遗传差异，在特定的 基因座上不同个体的等位基因之间由碱基 序列差异构成的DNA多态性叫做序列多态性。 • 实验目的：验证β-Gbobin gene 多态性
PCR产物胶回收实验
PCR产物胶回收实验引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术。
在PCR实验中，扩增产物通常需要从琼脂糖凝胶上回收和纯化，以便进一步的分析和应用。
本文将介绍一种PCR产物胶回收的实验方法。
实验材料：1. 扩增产物：经过PCR扩增得到的DNA片段。
2. 琼脂糖凝胶：用于扩增产物分离和纯化。
3. 胶回收缓冲液：用于胶回收的缓冲液。
4. 真空浓缩仪：用于回收DNA片段。
5. 无菌纯水：用于制备实验溶液。
6. DNA电泳仪：用于检测和分析PCR产物。
实验步骤：1. 准备琼脂糖凝胶：a. 根据实验需要，制备适合的琼脂糖凝胶。
b. 加入适量的琼脂糖凝胶染料（如安全染料）。
2. 进行PCR扩增：a. 根据所需扩增片段的序列，设计引物，并合成引物。
b. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶等。
c. 进行PCR扩增反应。
3. 分析PCR产物：a. 用电泳法将PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。
b. 根据需要，记录PCR产物的迁移距离和片段大小。
4. 准备胶回收缓冲液：a. 根据实验所需，制备合适的胶回收缓冲液。
5. 胶回收：a. 使用刮胶刀将PCR产物切下，放入离心管中。
b. 添加足够的胶回收缓冲液，使产物完全浸没其中。
c. 低温热激活离心管以使产物与缓冲液充分混合。
d. 放入离心机中离心，以使产物完全沉积到离心管底部。
6. 剔除上清：a. 使用吸走器小心地吸取上清，避免吸取产物。
b. 检查离心管底部是否完全干燥，如有残余液体则继续吸取。
7. 回收DNA片段：a. 加入适量的无菌纯水，以溶解和洗涤DNA片段。
b. 用手轻轻摇晃离心管，使DNA片段溶于水中。
c. 使用真空浓缩仪，将溶解的DNA片段浓缩至所需浓度。
8. 分析纯化后的PCR产物：a. 用电泳法将纯化后的PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。
b. 检查PCR产物的迁移距离并与之前的分析结果进行比较。
结论：通过PCR产物胶回收实验，我们成功地从琼脂糖凝胶中回收和纯化了PCR扩增的DNA片段。
pcr产物纯化回收跑胶试验结果分析
pcr产物纯化回收跑胶试验结果分析PCR产物的回收（玻璃奶吸附法）SYBR会使DNA部分显出绿色荧光，在紫外灯下辨认绿色荧光，可将胶切下。
实验结果及分析本次试验中，在最后一步检测中看到了荧光，说明了DNA的存在，证明回收到了PCR的产物PCR产物的直接纯化：一、原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。
目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。
本实验中， Buffer PCR-A促使大于100bp 的DNA片段选择性地吸附到 silica膜上。
经 Buffer W. BufferW2洗涤去除残留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到sica膜上的DNA片段经微量水或 Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。
二、材料与方法1、材料PCR产物2、仪器、用具恒温孵育器（65C)、离心机、移液器、1.5ml离心管3、试剂Buffer_PCR -A Buffer w1；已加无水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去离子水4、方法(1）在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A若需加入的BufferPCR-A不足100ul，则加入100ul。
(2）将DNA --prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中，将步骤（1）中的混合液移入DNA -prep Tube I中，5500rpm离心1min。
(3）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入500 ul Bufer W1,5500rpm离心1min。
(4）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入700山已加无水乙醇的 Buffer V2,5500rpm离心1min，以同样的方法再用700山己加无水乙醇的 Buffer\2洗涤一次。
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溶液C
溶液D 离心柱
25 ml
8 ml 100个
使用前加入100 ml无水乙醇
TE buffer 单个最大吸附量20 µg
实验前试剂准备：溶液C中加入100 ml无水乙醇。
四、实验步骤
1、在PCR产物中加三倍体积的溶液A（150ul）; 充分混匀； 2、加入50 ul溶液B，震荡混匀； 3、将溶液置于离心柱中，静置2 min，12000 rpm离心30 s； 4、倒掉液体，加入500 ul溶液C，于离心柱中12000 rpm离心30 s，弃液体； 5、重复步骤4； 6、12000 rpm再次离心1 min，甩干剩余液体以除去残余酒精； 7、将离心柱置于新的离心管中，室温敞盖放置5~10 min，使乙 醇挥发殆尽； 8、加入20 ul溶液D（溶液D用前50℃预热），静置2 min； 9、12000 rpm离心2 min，管底溶液即为所需DNA； 10、纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳。
五、结果与分析
1、记录电泳结果图，标注marker每个条带代表片段大小， 标注Gt5GT7片段大小。
六、预实验结果
DL2000 Gt5GT7 Gt5GT7 Gt5GT7 Marker
1892 bp
2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 kb 100 bp
PCR反应体系
PCR反应
目标条带
回收产物的电泳分析
PCR产物回收
三、材料仪器
1、材料：pCR4TOPO-Gt5GT7的PCR产物； 2、仪器：台式高速离心机，水平电泳槽，电泳仪。 3、DNA快速回收/纯化试剂盒 100T（成分如下表）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
成分
溶液A 溶液B
规格
100 ml 7 ml
注意事项
温度低时，可能有晶体沉淀， 加热溶解即可。
实验九 PCR产物回收
一、实验目的
• 掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法。
二、实验原理
• PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些 成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反 应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多， 回收试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。 • 本实验采用北京鼎国昌盛生物技术有限公司的DNA快速回 收/纯化试剂盒100T，原理是：其所带硅基质膜，具有在 高盐、低PH值情况下吸附DNA，低盐、高PH值情况下释放 DNA的性质。