高效液相色谱法测定猪肉中土霉素、四环素和金霉素
畜禽肉中土霉素,四环素,金霉素的测定
畜禽肉中土霉素，四环素，金霉素的测定食品安全检验手册101页１.原理 样品中土霉素，四环素，金霉素经提取，用微孔滤膜过滤后进HPLC 色谱仪测定 ２.试剂和材料⑴乙腈 色谱纯⑵高氯酸 分析纯;⑶高氯酸溶液 5%(V/V)⑷土霉素标准品 纯度≥99%;⑸土霉素标准贮备液 准确称取10.0mg 土霉素,用甲醇配制浓度为100μg/mL 的标准贮备液。
⑹土霉素标准中间液: 准确吸取5.0mL 土霉素标准贮备液,于50mL 容量品瓶中,加水稀释至刻度。
摇匀,此液1mL 含10μg 氯霉素。
⑺土霉素标准系列溶液: 准确吸取土霉素标准中间液0.1,0.2,0.5,1.0，2.0mL 分别放于10mL 容量瓶中,然后,各加水至10.0mL. 摇匀,即得每mL 含 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 .2.0μg 的土霉素标准系列溶液。
３.仪器和设备(1) 液相色谱仪，配有紫外吸收仪;(2) 匀质器；(3) 离心机：6000r/min 。
４.测定步骤（1）提取 称取试样5g(精确至0.01g)，置于50mL 离心管中，加人25mL 高氯酸溶液：5%(V/V), 超声提取20min, 然后离心10min ( 4000r/min )。
取上清液，经0.45µm 滤膜过滤后，滤液作HPLC 用。
（2）测定高效液相色谱参考条件色谱柱:Grace Smart C 18 250mmX4.6mm, 5µm;测定波长: 350nm流速: 1.0mL/min;色谱柱温度:室温。
（3）色谱测定:① 标准曲线的制备 分别吸取土霉素标准溶液各20µL,在上述色谱条件下,进行HPLC 分析,以标准液浓度与峰面积进行回归分析。
② 样品测定 按上述色谱条件下,进样20µL, 进行HPLC 分析,根据保留时间和峰面积，与标准比较进行定性定量。
外标法定量。
５．结果计算m X ∨×=ρ （1-71）式中:X—试样中土霉素残留量, μg/gρ—测定液中土霉素的含量, μg/mLV--试样溶液的体积, mLm-试样的质量,g 。
高效液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中土霉素、四环素、金霉素、多西环素的不确定度评估
DOI:10.20041/ki.slbl.2023.03.004高效液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中土霉素、四环素、金霉素、多西环素的不确定度评估刘继明，刘道中*，强莉，宫玲玲，杨志强，梁萌*，战余铭，路雅兰，郭腾（山东省饲料兽药质量检验中心/山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南250100）摘要：试验旨在采用高效液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中土霉素、四环素、金霉素、多西环素的含量，并进行不确定度的来源分析和评定。
根据农业农村部第282号公告《饲料中土霉素、四环素、金霉素、多西环素的测定》，通过对样品称量、样品提取、标准溶液配制、仪器检测及标准曲线建立等主要因素进行考察，并建立数学模型，计算不同因素对药物检测时不确定度的影响。
结果表明：标准溶液配制、标准曲线建立对检测不确定度的贡献较大，而样品称量对不确定度的影响较小，进一步得出合成不确定度和扩展不确定度。
配合饲料中土霉素、四环素、金霉素、多西环素检测值分别为51.98、52.35、52.95、51.93μg·kg-1时，其扩展不确定度分别为9.66、6.78、8.88、8.91μg·kg-1（P=95%,k=2）。
关键词：高效液相色谱-串联质谱法；配合饲料；抗生素检测；四环素类药物；不确定度中图分类号：S816.2文献标志码：A文章编号：1001-0084（2023）03-0018-07Evaluation of Uncertainty in Determination of Oxytetracycline,T etracycline,Aureomycin and Doxycycline in Compound Feeds by High Performance LiquidChromatography-tandem Mass SpectrometryLIU Jiming,LIU Daozhong*,QIANG Li,GONG Lingling,YANG Zhiqiang,LIANG Meng*,ZHAN Yuming,LU yalan,GUO Teng（Shandong Center for Quality Control of Feed and Veterinary Drugs/Shandong Provincial Key Laboratory ofQuality Safety Monitoring and Risk Assessment for Animal Products,Jinan250010,China）Abstract:The purpose of this test is to determine the contents of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline in compound feed by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,to analyze and evaluate the source of uncertainty.According to the Announcement No.282of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs,"the determination of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline in feed",the influence of different factors on the uncertainty of drug detection was calculated by investigating the different factors such as sample weighing,sample extraction,standard solution configuration,instrument determination收稿日期：2023-02-24基金项目：盐湖特色矿物质饲料添加剂研发与应用（YDZX2022148）；绿色高效蛋鸡饲料配制技术示范与推广（SDNYXTTG-2023-25）作者简介：刘继明（1970—），男，山东邹平人，正高级畜牧师，主要从事饲料技术研究、技术指导、饲料营养物质检验、饲料中非法添加剂物筛查、动物尿液中β受体激动剂的检测等工作。
高效液相色谱-质谱法分析(土霉素 四环素 金霉素 强力霉素)原始记录
××/××-074-2
样品处理
按照GB/T18932.23-2003对样品进行处理。
标准溶液名称/浓度
土霉素,金霉素,四环素,强力霉素标准溶液浓度：100μg/ml
色谱条件
色谱柱：UPLC-C18
柱温：40 ℃
流速：0.4 mL/min
进样量：10 μL
流动相：甲醇+甲酸水梯度洗脱
高效液相色谱-质谱法分析（土霉素 四环素 金霉素 强力霉素）原始记录
第1页，共页
检测项目
土霉素四环素金霉素强力霉素
检测开始时间
年月日
检测依据
GB/T18932.23-2003
检测结束时间
年月日
检测方法
高效液相色谱质谱联用法
温度/相对湿度
℃％
仪器名称/型号
PE Qsight220/A30
仪器编号
××/××-070-2
四环素Y=aX+b a= b= r=
金霉素Y=aX+b a= b= r=
强力霉素Y=aX+b a= b= r=
测定低限
土霉素、四环素0.001mg/kg;金霉素、强力霉素0.002mg/kg
计算公式
计算公式：X=
式中：X--样品中待测组分的残留量，单位为（mg/kg）;
V--样品定容体积，单位为（mL）；m--样品质量，单位为（g）；
质谱条件
离子化模式：ESI+
质谱扫描模式：MRM
母离子
土霉素
四环素
金霉四环素
金霉素
强力霉素
定量离子
土霉素
四环素
金霉素
强力霉素
定量方法标准曲线
序号
高效液相色谱法测定水产品中土霉素_四环素_金霉素
[作者简介] 刘丽(1970-),女,本科,副主任技师,主要从事理化检验工作。
【化学测定方法】高效液相色谱法测定水产品中土霉素、四环素、金霉素刘丽,蔡志斌,张英(广东省深圳市龙岗区疾病预防控制中心,广东深圳 518172)[摘要] 目的:建立高效液相色谱法测定水产品中土霉素、四环素、金霉素。
方法:选择乙腈-0101mol/L柠檬酸溶液为流动相体系,采用梯度洗脱,流速0～6m in为014m l/m in;6～7m in为014～018m l/m in;7～12m in为018m l/m in。
结果:当检测波长为355n m时,土霉素检出限为01010mg/kg,四环素为01008mg/kg,金霉素为01035mg/kg,线性范围为0104～110mg/kg,相关系数为01999,相对标准偏差为1135%,加标回收率为85%～120%。
结论:此测定方法简便,结果可靠,灵敏度高。
[关键词] 土霉素;四环素;金霉素;高效液相色谱[中图分类号] O65717+2 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2007)08-1405-02D etecti on of three an ti b i oti cs i n aqua ti c products by HPLCL iu L i,Cai Zhi2bin,Zhang Ying(Longgang Center for D isease Contr ol and Preventi on,Shenzhen518172,China)[Abstract] O bjecti ve:To esteblish a si m p le method f or si m ultaneous detecti on of oxytetracycline,tetracycline,chl ortetracycline in aquatic p r oducts by HP LC1M ethods:A gradient eluti on method of citric acid with0101mol/L acet onitrile was used1The fl ow rate was014m l/m in in0～6m in,then ascent t o018m l/m in in the next2m in and kep t invariable t o the end1The detecting wavelength was355n m1Results:The li m it of detecti on was01010mg/kg for oxytetracycline,01008mg/kg for tetracycline, 01035mg/kg for chl ortetracycline,and the linear range was0104～110mg/kg(r=01999)1The relative standard deviati on was 1135%and the recovery was85%～120%1Conclusi on:The method is si m p le,sensitive and accurate,and it can be used t o de2 tect the three antibi otics in aquatic p r oducts1[Key words] Oxytetracycline;Tetracycline;Chl ortetracycline;HP LC 对畜、禽肉类中土霉素、四环素、金霉素的测定,有国家标准方法G B/T50091116-2003[1],但该方法用于水产品(包括其干制品)的处理效果不太理想。
高效液相色谱法测定四环素类抗生药物中土霉素_强力霉素_四环素和金霉素
理化检验 —化学分册
吕海涛等 :高效液相色谱法测定四环素类抗生药物中土霉素 、强力霉素 、四环素和金霉素
的吸附作用 ,往往会引起色谱峰拖尾 ,柱效下降 。根 据四环素类药物在中性或碱性条件下能与 Mg2 + 、 Ca2 + 等很多金属离子反应生成具有强紫外吸收的 稳定配合物的特点 ,本文利用高效液相色谱法 ,使用 光电二极管阵列检测器 ,建立了一种简便 、快速 、灵 敏的测定四环素类药物的方法 ,能同时测定四环素 (O TC) 、土霉素 ( DC) 、金霉 素 ( C TC) 和强 力霉 素 ( TC) ,并成功地应用于抗生素药片中四环素类药物 的测定 。
L Β Ha i2tao
( T he Col le ge of S cience , L ai y an g A g ricult u ral U ni versi t y , S han don g 266109 , Chi na)
CHEN Feng
( De pt. of B ot any , T he U ni versit y of Hon g Kon g)
称取 经 粉 碎 过 筛 后 的 四 环 素 类 药 片 粉 末 0. 200 0 g ,加入流动相 B 液 50 mL ,在常温下超声 波浸取 10 min ,过滤 ,用少量流动相 B 洗涤残渣 ,定 容至 100 mL 。分析测定时 ,再用流动相 B 稀释至适 当的浓度 。此溶液可在 4 ℃暗处稳定放置 2d 。
(香港浸会大学 生物学系 , 香港)
摘 要 : 利用高效液相色谱 ,发展了一种快速 、灵敏 、同时测定土霉素 、强力霉素 、四环素和金霉 素的方法 。在反相 C18 柱上进行梯度洗脱分离 ,流动相由甲醇和乙酸钠缓冲溶液组成 (内含 ED TA 和氯化钙 ,p H 8. 10) , 紫外检测波长为 386 nm 。四环素类药物的质量浓度在 8～4 000μg ·L - 1 范 围内呈线性关系 ,回收率为 95 %～102 % ,相对标准偏差为 1. 2 %～3. 6 % ,检出限分别为 6 ,13 ,6 和 7μg ·L - 1 ,方法应用于四环素类抗生药物的分析 。
高效液相色谱法对畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素的残留检测研究
恒温振荡 20 min，再超声 5 min，最后在 25 ℃、7 000 r/min
离心 5 min。重复 1 次后，合并上清液于鸡心瓶中，用旋转
蒸发器蒸发至近干，然后准确加入 2.00 mL 乙腈溶解后转移
到 2 mL 离心管中高速离心，上清液经过 0.45 μm 滤膜，滤
液供液相色谱测定，本方法色谱图见图 1。
（2）提取液。将磷酸盐缓冲液与乙腈按照 2 ∶ 1 的比例 混合（pH=2.5）。
所有玻璃器皿包括样品瓶均用 10% 的硝酸浸泡（长时间 较好），之后放置在马弗炉中于 250 ℃条件下烧 2 h。
表 1 目标抗生素结构式及主要性质
结构式
中英文 简称
主要性质
OH O
OHOHO
O NH2
OH HO CH3 H N(CH3)2
1.4 质量控制
定性依据：相对于标样，保留时间差别在 2% 以内；定
量方法：外标法定量；方法检出限（MDLs）：将实际环境
样品不断稀释进样（S/N ≥ 3）。
作者简介：吕振娥（1987—），女，河南南阳人，硕士，农艺师。研究方向：农产品质量安全。
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四环素 TC
1. 四环素 pKa 约为 3.32，在有 氧、光照、强酸碱条件下会降 解产生多种代谢产物，一定条 件下代谢产物会转化为母体。
2. 溶于甲醇且易溶于水
OH O
OHOHO
O NH2
OH HO CH3OHH N(CH3)2
土霉素 OTC
1. 土霉素母体易溶于甲醇， pKa 值为 3.22；
2. 土霉素很容易降解为差向土 霉素，且差向土霉素对动物的
MM_FS_CNG_0265 畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法(高效液相色谱法)
畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法（高效液相色谱法）.适用范围本方法适用于各种食用畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量地测定.最低检出浓度为：，，／..原理概要样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素.标准加法定量..主要试剂和仪器.主要试剂乙腈（分析纯）；／磷酸二氢钠溶液：称取（±）磷酸二氢钠（·）溶于蒸馏水中，定容到，经微孔滤膜（μ）过滤，备用；土霉素（）标准溶液：称取土霉素（±），用／盐酸溶液每毫升含土霉素；四环素（）标准溶液：称取四环素（±），用／盐酸溶液溶解并定容，此溶液每毫升含四环素；金霉素（）标准溶液：称取金霉素（±），溶于蒸馏水并定容成，此溶液每毫升含金霉素；以上标准品均按单位／折算.～溶液应于℃以下保存，可使用周；混合标准溶液：取四环素、四环素标准溶液各，取金霉素标准溶液，置于容量瓶中，加蒸馏水至刻度.此溶液每毫升含土霉素、四环素各，金霉素，临时现配；％高氯酸溶液..仪器高效液相色谱仪（）：具紫外检测器..色谱条件柱：（μ）×；检测波长：；灵敏度：；柱温：室温；流速：／；进样量：μ；流动相：乙腈／／磷酸二氢钠溶液（用％（／）硝酸溶液调节），∶（／），使用前用超声波脱气..过程简述.样品测定：称取（±）切碎地肉样（＜），置于锥形烧瓶中，加入％高氯酸，于振荡器上振荡提取，移入到离心管中，以／离心，取上清液经μ滤膜过滤，取溶液μ进样，记录峰高，从工作曲线上查得含量..工作曲线：分别称取份切碎地肉样，每份（±），分别加入混合标准溶液、、、、、、μ（含土霉素、四环素各为、、、、、、μ，含金霉素、、、、、、μ），按方法操作、以峰高为纵坐标，以抗生素含量为横坐标，绘制工作曲线..计算＝××式中：——样品中抗生素含量，／；——样品溶液测得抗生素质量，μ；——样品质量，..来源：／—。
高效液相色谱法检测畜禽肉中四环素类药物残留的条件优化
高效液相色谱法检测畜禽肉中四环素类药物残留的条件优化张鑫;顾欣;严凤;蒋音【摘要】对畜禽肉中四环素类残留的检测方法进行改进,选用Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液作为提取液进行超声提取,经C18固相萃取小柱净化,脱溶剂后用流动相三氟乙酸-乙腈溶解,使用高效液相色谱-PDA检测器分段采集355 nm及270 nm波长下的色谱信息,对前处理方法及色谱条件进行优化.四环素、土霉素在0.01～1 μg/g范围内,金霉素、多西环素在0.02～2μg/g范围内回收率为60%～85%,相对标准偏差小于5%,可以满足国家残留限量0.1～0.6μg/g的检测要求.【期刊名称】《化学分析计量》【年(卷),期】2010(019)005【总页数】4页(P55-58)【关键词】残留;四环素;土霉素;金霉素;多西环素;高效液相色谱;分段采集【作者】张鑫;顾欣;严凤;蒋音【作者单位】上海市兽药饲料检测所,上海,201103;上海市兽药饲料检测所,上海,201103;上海市兽药饲料检测所,上海,201103;上海市兽药饲料检测所,上海,201103【正文语种】中文四环素类药物(TCs)具有广谱抗生活性，有良好的杀菌抑菌作用，并且价格便宜，经常作为饲料添加剂用于畜牧及水产养殖，常见的TCs包括四环素(Tetracycline,TC)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、金霉素(Chlortetracycline，CTC)、多西环素(Doxycycline, DC)等。
但是滥用及不当使用造成的动物源性食品中四环素类残留会对人体健康造成危害，因此四环素类药物残留的检测具有重要意义。
四环素类在化学结构上具有共同的基本母核——氢化并四苯环，仅取代基有所不同，TCs易与金属离子螯合，在pH 2～6的弱酸性溶液中易发生差向异构化，在pH<2的酸性、中性或碱性溶液中易降解。
由于TCs的强极性性质，在生物样品中易与蛋白质形成共轭物而提取困难。
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高效液相色谱法测定猪肉中土霉素、四环素和金霉素范露，靖涵之（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，武汉 430205）摘要：对高效液相色谱法测定猪肉中土霉素、四环素和金霉素残留方法进行了优化，样品经0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（pH=3.5）提取，选用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，以乙腈+0.01 mol/L NaH2PO4作为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长365 nm，进样量10 μL，外标法定量。
三种抗生素在0.01 mg/mL～1 mg/mL范围内线性关系良好，土霉素和四环素检出限为0.125 mg/kg，金霉素检出限为0.4 mg/kg，相对标准偏差在5%以内，三种抗生素加标回收率在72.1%～101.5%之间。
该方法操作简便，能够较好地满足四环素类抗生素残留现行检测标准要求。
关键词：高效液相色谱法；猪肉；土霉素；四环素；金霉素；测定中图分类号：O657.72/TS251.5+1文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2019）03-0162-07 Determination of oxytetracycline，tetracycline and aureomycin in pork by high performance liquid chromatographyFAN Lu，JING Han-zhi（College of Food & Biology Science and Technology，Wuhan institute of design and sciences，430205）Abstract：The method for determination of oxytetracycline，tetracycline and aureomycin in pork by high performance liquid chromatography was optimized. The sample was extracted with 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution （pH=3.5），the ZORBAX Eclipse XDB-C18 column was used to separate three antibiotics，and mobile phase was gradient eluted with acetonitrile+0.01 mol/L NaH2PO4，the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 30℃，detection wavelength was 365 nm，injection volume was 10 μL，external standard method was selected to quantitative analysis. The linearity of three antibiotics was good in the range of 0.01 mg/mL～1 mg/mL，the detection limit of oxytetracycline and tetracycline was 0.125 mg/kg，the detection limit of aureomycin was 0.4 mg/kg，and relative standard deviation was within 5%，the recoveries of three antibiotics were between 72.1% and 101.5%. The method is simple and convenient，and meets the requirements of current detection standards for tetracycline antibiotic residues.Key words：high performance liquid chromatography；pork；oxytetracycline；tetracycline；aureomycin；determination收稿日期：2018-11-26作者简介：范露（1982-），女，副教授，研究方向：食品加工与安全。
162163四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱性抗生素，包括土霉素、四环素、金霉素等［1］，其在降低动物发病率与死亡率、促进动物生长和改善产品质量上起到了非常重要的作用［2］。
但长期滥用四环素类药物，会导致其在动物性产品内残留，对人体健康造成伤害。
国家标准［3］采用高效液相色谱法测定畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留，除此之外还有液质联用法［4］、ELISA 法［5］、化学发光法［6］、极谱法［7］、紫外分光光度法［8］等。
但根据国家标准中的条件测定时，三种抗生素的分离效果并不理想（见图1第一个色谱图），因而对其测定条件进行优化，以期达到更好的分离效果。
1 材料与方法1.1 材料与试剂土霉素标准品和四环素标准品购自博美生物科技有限公司，金霉素标准品购自金穗生物科技有限公司；乙腈、甲醇为HPLC 级，其余试剂为分析纯。
试验用水为纯水。
所有溶剂使用前均用0.45 μm 滤膜过滤。
标准品配制：准确称取土霉素、四环素和金霉素标准品各0.050 g ，分别用0.1 mol/L HCl 、0.01 mol/L HCl 和纯水溶解并定容至50 mL ，使各抗生素浓度为1.0 mg/mL ，于4 ℃条件下贮存备用。
0.1 mol/L Na 2EDTA -Mcllvaine 缓冲溶液配制：将1000 mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液混合，此溶液为Mcllvaine 缓冲溶液。
称取60.5 g 乙二胺四乙酸二钠加入1625 mL Mcllvaine 缓冲溶液中，使其溶解，摇匀，即为0.1 mol/L Na 2EDTA -Mcllvainemin246810mAU 020********* VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001658.D)min01234567mAU 020406080100120140 VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001657.D)min1234567mAU 0255075100125150175 VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001656.D)min0123456789mAU050100150200250VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001655.D)NaH 2PO 4+乙腈=65+35NaH 2PO 4+乙腈=70+30NaH 2PO 4+乙腈=75+25NaH 2PO 4+乙腈=80+20土霉素四环素金霉素图1 等度洗脱条件下不同流动相配比抗生素色谱图Fig. 1 Chromatogram of antibiotics with different flow compatibility ratio under the condition of constant elution164缓冲溶液。
1.2 仪器与设备1260型高效液相色谱仪：包括四元泵、在线真空脱气机、柱温箱和紫外检测器，美国Agilent 公司；AL -104型分析天平：瑞士Metteler toledo 公司；FE20型pH 计：瑞士Metteler toledo 公司；Neofuge 18R 型台式高速冷冻离心机：香港Heal Force 公司；JP -031S 型超声波清洗机：深圳洁盟超声波清洗设备有限公司。
1.3 色谱条件按照GB/T 5009.116-2003，色谱条件如下，色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB -C 18，流动相：乙腈+0.01 mol/L NaH 2PO 4（用30%硝酸调节pH 至2.5，过0.45 μm 微孔滤膜）=35+65，流速： 1 mL/min ，柱温30 ℃，检测波长：355 nm ，进样量10 μL 。
1.4 实验方法准确称取5.00 g 样品，分两次加入40.0 mL 5% HClO 4溶液匀浆，匀浆液转移至50 mL 容量瓶中并用蒸馏水定容至刻度，振荡混匀，以10000 r/min 离心10 min ，取上清液，过0.45 μm 微孔滤膜，收集滤液，取10 μL 样品提取液注入液相色谱仪中，采用外标法定量。
根据标准品中各分析对象保留时间和峰面积进行定性和定量分析。
2 结果与分析2.1 色谱条件优化2.1.1 流动相优化试验结果研究了等度洗脱下各抗生素分离效果影响，结果见图1所示。
从图1可以看出，在等度洗脱条件下，随着min123456789mAU 0255075100125150175 VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001662.D)min0123456789mAU 020406080100120140 VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001661.D)min0123456789mAU 020406080100120140 VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001660.D)min0123456789mAU020406080100120140160 VWD1 A, Wavelength=355 nm (E:\邱朝坤\抗生素\S IG1001659.D)程序1程序2程序3程序4图2 梯度洗脱条件下不同条件抗生素色谱图Fig. 2 Chromatogram of antibiotics under different conditions of gradient elution165乙腈比例的降低，土霉素和四环素的分离效果逐渐变好。
当NaH 2PO 4+乙腈=65+35时，两者完全不能分离，而当NaH 2PO 4+乙腈=75+25时两者已经能够完全分离。
但随着乙腈比例减少时，金霉素峰形越来越扁平，出峰时间越来越滞后，因而乙腈在流动相中的比例会导致土霉素、四环素和金霉素的分离效果产生矛盾，因此考虑进行梯度洗脱，先使土霉素和四环素流出色谱柱，再改变流动相配比使金霉素流出色谱柱。