基因功能研究
基因功能验证
基因功能验证基因功能验证是指通过实验方法来对基因进行验证和理解其功能的过程。
在基因功能验证中，科学家可以通过一系列实验来确定特定基因对生物体的作用，也可以进一步理解这些基因在细胞和生物过程中起到的作用。
以下是基因功能验证的一些常见方法：1. 基因敲除/突变基因敲除或突变是指通过实验方法的手段来破坏或改变一个特定基因的功能。
这可以通过遗传学方法（例如利用CRISPR-Cas9技术）或化学方法（例如使用小分子抑制剂）来实现。
通过基因敲除或突变，科学家可以研究这些基因在实验模型中的缺失或变异对生物体的影响，从而验证基因的功能。
2. 基因表达/过表达基因表达/过表达是指将感兴趣的基因转录为相应的蛋白质。
科学家可以使用DNA克隆技术将特定基因转移到模型生物的细胞中，并在其细胞内进行表达。
通过对基因表达/过表达的实验，科学家可以观察到这些过表达基因对生物体的影响，进一步验证和理解该基因的功能。
3. 蛋白质交互/亚细胞定位蛋白质交互/亚细胞定位实验可以帮助科学家理解基因编码的蛋白质在细胞内的相互作用和定位。
这些实验可以使用蛋白质结合实验（例如酵母双杂交系统）或免疫共沉淀等方法来实现。
通过确定特定基因编码的蛋白质与其他蛋白质的交互作用以及其在细胞内的定位，科学家可以进一步验证和理解该基因的功能。
4. RNA干扰 (RNAi)RNA干扰是一种通过干扰特定基因的转录和翻译来研究基因功能的方法。
通过合成小分子RNA分子，可以选择性地靶向破坏特定基因的mRNA，从而抑制该基因的表达。
通过观察RNAi实验后生物体的表型变化，科学家可以验证并理解这些基因在生物过程中的功能。
综上所述，基因功能验证是通过一系列实验方法来验证和理解特定基因的功能。
通过基因敲除/突变、基因表达/过表达、蛋白质交互/亚细胞定位和RNA干扰等实验方法，科学家可以进一步验证和理解基因在细胞和生物过程中的作用。
这些方法不仅有助于我们对基因功能的认识，也为研究基因相关疾病和开发治疗手段提供了重要的实验依据。
分子生物学研究法-基因功能研究技术
分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。
但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。
如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。
转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。
用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。
酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。
随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。
本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。
6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。
通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。
研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
➢ 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能
存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编
植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外
源基因在转基因植株中成功表达。
➢植物中有许多转座子系统，它们的转座机
制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-
的贡献，也可列出很长的一串名单。 Bait protein。
基因功能分析范文
基因功能分析范文
现代生物学技术在改善和处理人类健康问题方面发挥着重要作用。
其中，基因功能分析是一种生物学技术，用于研究基因的表达和功能，以及
从基因组变异中获取关于状态和疾病的信息。
基因功能分析技术主要用于
研究基因作用的机制，以及研究疾病的发病机理、疾病的诊断、疾病的治
疗和疾病预防。
基因功能分析也被称为基因分析（Gene Analysis），基因组学（Genomics），转录组学（Transcriptomics）和蛋白质组学（Proteomics）等。
基因功能分析技术运用高通量测序技术、微阵列技术、质谱学技术等，能够表征基因的功能、表达模式、结构和相互作用等。
基因功能分析通过解析染色体上的基因的组织和功能，有助于确定哪
些基因参与发育和表达，以及参与哪些重要生物过程。
这种技术还能够确
定基因组变异与疾病发生和演变之间的关系，从而更好地理解基因是如何
参与疾病发生和发展的。
重要基因的发掘和功能研究
重要基因的发掘和功能研究随着基因技术的不断发展，我们有了更多的机会来对人类基因进行研究和探索。
这项研究也为人类医疗和健康提供了更好的解决方案。
在这个领域中，发现重要基因并研究它们的功能是一项重要的任务。
在这篇文章中，我们将探索如何发掘重要基因以及分析它们的功能。
基因是生物体遗传信息的载体，控制了生物体的所有生命活动。
为发掘重要基因，首先需要通过基因测序技术对基因组进行扫描。
在不同生物体中，基因和其组成的表达网络存在差异，基因测序可以帮助我们发现这些差异并分析它们的含义。
具体来说，基因测序可以帮助我们发现基因的变异和序列重复，这些变异和重复在某些情况下会导致基因表达的改变，影响人们的健康和生命质量。
以人类疾病为例，如若要发掘与疾病有关的基因，研究者可以通过疾病患者和健康人士的基因测序结果进行比对。
对比结果可以发现在患病人群中出现频率较高的变异，这些变异可能与疾病的发生和发展密切相关。
例如，BRCA1和BRCA2基因的突变与乳腺癌和卵巢癌的发生率有很大关系，因此这两个基因被认为是致癌基因。
因此，通过基因测序技术可以发现与疾病相关的基因，从而在发现和治疗疾病方面产生重大影响。
一旦确定了重要基因，接下来就需要对这些基因的功能进行深入研究。
基因的功能可以通过多种方法进行分析和验证，其中包括基因敲除技术、基因过表达技术、功能性基因组学和CRISPR/Cas9等现代基因编辑技术。
基因敲除技术是将基因从生物体中彻底删除，从而研究其对生命活动的影响。
例如，通过将BRCA1和BRCA2基因从小鼠中敲除，研究人员发现小鼠的卵巢和乳房会产生不同的变化，这进一步确认了这两个基因与癌症有关。
同样的，基因过表达技术是将基因在生物体中过度表达，从而研究其对生命活动的影响。
这些技术可以帮助我们更深入地理解基因的功能和生物体的生命活动规律。
除了基于基因编辑技术的研究方法，功能性基因组学也是对基因功能进行分析的重要方法。
功能性基因组学通过对基因产物进行组学分析，了解其对蛋白质相互作用、代谢途径和信号转导的影响，从而深入挖掘基因的功能。
基因功能研究第一步：轻松敲基因
基因功能研究第一步：轻松敲基因基因研究中，敲除基因，研究该基因的功能是最常用的套路。
一般 ShRNA 可通过 RNA 干扰来抑制基因的表达，是基因研究中必不可少的环节。
下面就主要围绕设计ShRNA 引物序列，手把手教你构建ShRNA 质粒，轻松敲基因。
ShRNA 的设计原则1. 克隆到ShRNA 表达载体中的ShRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ 启动子控制。
随后在连上 5～6 个 T 作为 RNA 聚合酶Ⅲ 的转录终止子。
2. 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。
3. ShRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。
4. 5～6 个 T 必须放置在 ShRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶 III 终止转录。
5. 在正义链和反义链序列上不能出现连续3 个或以上的T。
这可能导致 ShRNA 转录的提前终止。
下面以 pSUPER 质粒载体设计 ShRNA 为例：1. 选择双酶切位点分别是 BglII-HindIII site。
2. pSUPER ShRNA design model：红色部分包含限制性酶切位点，绿色部分为茎环序列。
3. shRNA 的引物设计呢，可以从 Sigma 网站上进行查询。
（1）进入 sigma 网站，点击 search for shrna clones。
（2）在对话框输入基因名称。
（3）在基因 products 里面找到 shrna panels，点击进入。
（4）根据自己所要敲除的物种，human 或者 mouse，点击价格进入。
（5）如图，得到 shrna 序列，一般左上角带有 VALIDATED 标志的序列，为已知验证序列，而且还可以看到平均敲减效率为0.66。
可优先选择已验证并且敲减效率高的引物序列。
（6）选择第一条，得到如下序列，一般由于构建质粒载体不同，酶切位点也有所不同，sigma 官网的引物起始碱基 CCGG 是酶切位点序列，TACTCGAGTA 是茎环结构，TTTTT 是 RNA 聚合酶Ⅲ 的转录终止子。
新基因功能研究的策略和方法
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利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
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序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
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此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
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主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
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Probe mixture
Scan with two wave length scanner
Data analysis, finding new gene sequences and differential expression gene
肝癌基因表达谱变化分析 与肝癌的诊断 肝癌的基因调控机理研究 从基因表达谱特征诊断肝癌
基因功能研究的方法
生物信息学－以计算机为主要工具，开发各种软件，对日益增长的DNA、RNA和蛋白质的序 列和结构等相关信息进行收集、储存、发行、提取、加工、分析和研究，同时建立理论模型， 指导实验研究。 基因芯片－已知基因组全部或部分信息，进行的高通量基因功能研究； 差异显示技术－基因组信息知之甚少或未知，但有明确的表型差异样本；包括 mRNA差异显示（mRNA-Differential Display，mRNA-DD）， 抑制性消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，SSH） cDNA代表性差异分析（cDNA Representational Difference Analysis，cDNA-RDA） …… 过表达研究－将一个外源的基因构建于表达载体或病毒载体或由转座子携带，转入特定细胞， 分析基因和特定表型的关联性； RNAi干扰－将一段与靶序列完全配对的双链RNA引入特定细胞，该双链RNA与靶序列结合后， 导致靶序列断裂，进而引起靶序列的降解，从而阻止靶基因的表达，籍此分析基因和特定表 型的关联性； 转基因－将一个外源的基因构建于表达载体或病毒载体或由转座子携带，通过基因工程方法， 使外源基因整合入模式生物的基因组，并且在模式生物体内稳定表达特定外源基因，籍此分 析基因和特定表型的关联性； Knockout or knockdown动物模型－在整体水敲除或敲减特定基因，分析基因和特定表型的关 联性
生物信息在基因功能研究中的应用
生物信息学是生物学，计算机科学，以及应用 数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科。 以计算机为主要工具，开发各种软件，对日益 增长的DNA、RNA和蛋白质的序列和结构等 相关信息进行收集、储存、发行、提取、加工、 分析和研究，同时建立理论模型，指导实验研 究。由数据库、计算机网络和应用软件三大部 分构成，在基因功能研究中发挥巨大作用
Subtractive cloning
基因过表达在基因功能研究中的应用
原理 技术方法 应用实例
基因芯片技术的应用
在有足够的基因组信息物种中，通过基 因芯片，分析两类样本，比如正常组织 和疾病组织间基因表达的差异，往往能 够从那些表达异常的基因中发现与疾病 发生、发展相关联的基因。
基因芯片的理论基础
targets Cy3 labeled mRNA from tissue A Cy5 labeled mRNA from tissue B hybridization
1. 差异性表达mRNA方法 （1）mRNA差异显示（mRNA-Differential
Display，mRNA-DD）
（2）抑制性消减杂交（Suppression Subtractive
Hybridization，SSH）
（3）cDNA代表性差异分析（cDNA Representational Difference Analysis，cDNA-RDA） 2. 差异性表达蛋白质
分子分型 对放疗的敏感性 对化疗的敏感性 转移性 综合预后预测
已发现的各种肿瘤组织差异表达基因
肿瘤类型 例数
肝细胞癌 4
差异表达基因数
1234
新基因
634
胰腺癌
喉癌 胶质瘤 肺癌
3
4 4 3
1122
36 66 376
568
15 47 216
How to work on toxchip
生物NCBI PubMed
NCBI PubMed
NCBI gene
从基因序列开始的生物信息
在新基因的功能研究中，往往是从一些有差异的 表型开始，通过差异显示、基因芯片等方法获得 一群与表型相关联的基因的序列。对基因的深入 研究是费事、费力也消耗资源的事，在实验之前， 选择适当的基因进行深入研究就非常重要了。这 就是从基因序列开始的生物信息
研究基因功能的意义
基因和基因的功能
Genome DNA--人类基因组计划,
DNA水平的研究
转录（与调控）
前体 RNA
剪接、加工（与调控）
AAAAAAAAAA
mRNA--基因水平的研究 蛋白质--蛋白组学(proteomics)研究
翻译（与调控）
执行生物学功能
基因功能研究的开始－有差异的表型 基因功能研究的目的－链接基因和表型 之间的关联性
NCBI blastn
NCBI all Database
基因芯片的概念
将大量基因片段或寡核苷酸有序地、高密度地（点与 点间距一般小于500m)排列在玻璃、硅等载体上，称之为 基因芯片。基因芯片也叫作基因微矩阵（microarray)。 基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比 较和分析，以达到快速、灵敏和高通量地分析基因信息的 目的。
消减杂交（subtractive hybrization）
利用目的基因在两种组织或细胞中表达的差异，或者 在不同发育阶段、不同状态下表达差异，通过其 mRNA或单链cDNA进行杂交，除去两者之间相同的 基因成分，使表达有差异的基因得到充分富集。它的 实质是对两组基因转录本全面比较，去同存异，分离 差异表达基因。
基因芯片的其他应用
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 特殊属性基因筛选 药物敏感病人个体的筛选 转基因作物检测 遗传病的检测 感染性疾病的检测 耐药菌检测 药物敏感性检测 药物有效成分筛选 药物临床前毒性检测
差异表达
原理: 比较不同个体或不同细胞来源 ，即通常 所指的样本 (tester，Ｔ) 和参照 (driver， Ｄ) 的蛋白质或ｍRNA两者之间的差异 ， 如缺失或特异表达部分， 从而发现与特 定表型相关联的基因