新基因功能研究的策略与方法分析
基因测序技术的操作方法与分析策略
基因测序技术的操作方法与分析策略基因测序技术的快速发展使得人们能够更深入地了解生物体内基因的组成和功能。
它不仅在医学诊断和治疗上起到了重要作用，还在农业育种和环境保护等领域有广泛应用。
本文将介绍基因测序技术的操作方法和分析策略，旨在帮助读者更好地理解和使用这一技术。
一、基因测序技术的操作方法基因测序技术可以分为传统的Sanger测序和高通量测序两种方法。
传统的Sanger测序主要依靠荧光原位杂交技术进行，而高通量测序则采用了二代测序和第三代测序技术。
1. 传统的Sanger测序方法在传统的Sanger测序方法中，DNA片段首先被引物引导合成，形成不同长度的DDN基因片段。
然后，这些片段通过凝胶电泳分离，并使用荧光探针对其进行检测。
最后，测序结果会通过电泳图进行分析和解读。
2. 高通量测序方法高通量测序方法通过平行测序大量不同的DNA片段，从而实现了对整个基因组的测序。
目前常用的高通量测序技术主要包括Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序和Nanopore测序等。
Illumina测序是目前应用最广泛的高通量测序技术之一。
该技术通过将DNA片段连接到测序芯片上的特定位置，并进行多轮的合成和测序，最终得到高质量的测序结果。
Ion Torrent测序则是利用DNA链延伸的过程中产生的氢离子释放来进行测序。
这种方法速度快、成本低，并且适用于小规模测序项目。
PacBio测序利用了DNA链扩增和电泳分离的技术，可以获得较长的读取长度，并用于研究基因组的结构和变异。
然而，其测序错误率相对较高。
Nanopore测序技术则是通过将DNA片段通过纳米孔进行测序，通过对电流的变化进行分析和解读，进而得到基因序列信息。
这种方法具有实时性、易于操作等优点。
二、基因测序技术的分析策略基因测序技术的快速发展不仅使我们能够快速获取基因组信息，还需要相应的分析策略来对这些数据进行解读。
1. 数据质量控制在基因测序过程中，数据的质量控制非常重要。
基因功能研究的整体解决方案
BamHI
Sal I
Bgl II
XhoI
Sal I
2
BamHI
Bgl II
XhoI
Sal I BamHI
1
2
Bgl II XhoI
A）miRNA的串联
B ）miRNA串联试验结果
13
|
Life Technologies Proprietary & Confidential
|
miRNA载体特点-组织特异性表达miRNA
9
|
Life Technologies Proprietary & Confidential
|
BLOCK-iT™ miR RNAi Select
1. BLOCK-iT™ miR RNAi Select ：在Invitrogen网站的数据库里边 有已经设计好了的针对不同基因的oligo DNA（4对/一套）； Oligo DNA可以用来插入到BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression载体里边，进行RNAi研究。
|
RNAi Vector + RNA合成
standard siRNA
(21-mer overhangs)
Stealth™ RNAi
(25-mer blunt)
shRNA expression
miRNA expression
5
|
Life Technologies Proprietary & Confidential
|
体外合成RNAi vs. RNAi载体
体外合成RNAi 长效稳定沉默 RNAi载体
可调控的沉默
导入到难转染的细胞 沉默效果快速而强力 最高特异性 容易操作
遗传性疾病诊断中基因变异分析的方法和策略
遗传性疾病诊断中基因变异分析的方法和策略基因变异是指基因序列中发生的突变或改变，它是导致遗传性疾病发生的重要原因之一。
针对遗传性疾病的诊断和预防，基因变异分析是一种常用的方法和策略。
通过对个体的基因序列进行分析，可以帮助医生确定患者是否携带有致病基因，从而为疾病的早期诊断和治疗提供有力支持。
基因变异分析方法的选择和策略的制定需根据疾病的特性和遗传模式来确定。
目前常见的基因变异分析方法包括：Sanger测序、下一代测序（NGS）、聚合酶链反应（PCR）和寡核苷酸探针芯片等。
其中，下一代测序是目前应用最广泛的一种方法。
它可以高通量、高准确性地获取个体的基因组信息，包括常见和罕见的变异。
相比传统的Sanger测序，下一代测序不仅具有更高的分辨率，还可以同时检测多个基因，提高基因变异分析的效率。
基因变异分析的策略通常是根据疾病的类型和遗传模式来选择。
对于单基因遗传病，如囊性纤维化和先天性肌萎缩症等，策略是首先针对特定的致病基因进行检测。
这可以通过全外显子测序或者寡核苷酸探针芯片来实现。
如果已经明确患者的家族史，基因检测的策略可以根据患者家族史的特点来制定，例如先进行特定位点的突变筛查，再通过全外显子测序进行进一步分析。
对于复杂疾病，如常见疾病和多基因遗传病，策略较为复杂。
常见疾病通常涉及多个基因和环境因素的相互作用，例如糖尿病和高血压等。
在这种情况下，基因变异分析的策略主要是通过关联分析和基因组学的方法来识别与疾病相关的基因。
通过比较患者群体和健康对照群体的基因组信息，可以发现与疾病相关的位点和基因。
此外，基因变异分析还可以利用家系分析和同源性重组等方法来研究基因的遗传规律和变异的发生。
家系分析可以帮助确定变异基因的遗传模式，从而提供疾病的遗传风险评估。
同源性重组则通过观察基因组中的重组事件来研究遗传变异的发生机制。
在进行基因变异分析时，需要注意的是疾病的遗传异质性和基因本身的变异性。
不同个体之间基因变异的差异可能较大，因此需要确保选择正确的分析方法和策略。
多基因遗传病基因研究的策略和方法
多基因遗传病基因研究的策略和方法多基因遗传病是由多个基因的遗传变异所致的疾病，其研究策略和方法主要包括以下几个方面：1.基因组关联分析（GWAS）GWAS是一种广泛应用于多基因遗传病研究的方法，它通过对大量样本进行基因组分析，寻找与疾病相关的基因位点。
GWAS可以发现与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP），从而确定疾病的遗传风险因子。
GWAS的优点是可以发现新的遗传变异，但其缺点是只能发现单个基因的影响，而无法考虑基因之间的相互作用。
2.基因组学数据整合分析基因组学数据整合分析是将不同来源的基因组学数据整合起来，以发现与疾病相关的基因和通路。
这种方法可以将GWAS、转录组、蛋白质组等多种数据整合起来，从而更全面地了解疾病的遗传机制。
3.基因组学功能研究基因组学功能研究是通过对基因的功能进行研究，以了解其在疾病发生和发展中的作用。
这种方法包括基因敲除、基因表达调控、蛋白质相互作用等实验手段，可以揭示基因在疾病中的作用机制。
4.系统生物学分析系统生物学分析是将基因组学数据与生物学网络相结合，以了解基因之间的相互作用和通路。
这种方法可以揭示疾病的复杂性和多样性，从而为疾病的预防和治疗提供新的思路。
总之，多基因遗传病的研究需要综合运用多种方法和技术，以全面了解疾病的遗传机制和发展规律。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
研究基因功能的实验方案
基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进行验证，如何验证一个基因的功能，目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
1、功能获得策略是指将基因直接导入某一细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。
常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
2、基因的过表达技术：基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因的表达量增加的目的，可以使用的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。
基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。
可使用产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可用作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第一个部分是dCas9与VP64融合蛋白；第二个部分是含2个MS2 RNA adapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2 adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而达到增强基因表达的作用。
可使用产品：全基因Cas9 SAM-慢病毒文库2、功能获得两种方法的比较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。
而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达，可以不受基因大小的限制。
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
新基因功能研究的策略和方法
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
拟南芥中鉴定到一个F-box 蛋白——AtPP2-B11，在延 长盐处理时间时，其转录 水平和蛋白水平均出现显 著诱导表达。过表达 AtPP2-B11的转基因拟南芥 表现出明显的高盐耐受性， 而相应的RNA干扰株比野 生株对盐胁迫更敏感。 iTRAQ定量分析显示，在盐 胁迫下有4311个差异表达 蛋白受到AtPP2-B11调控。
细胞及动物水平验证
• 基因过表达细胞模型 • 基因沉默细胞模型
基因过表达细胞模型
•定义：通过载体将目的基因转入某一特定细 胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为 的变化，从而了解该基因的功能。 •应用：1）化学法 细胞感染
2）物理法 电穿孔法，效率高 3）生物法 应用病毒基因载体进行 转基因，复制产生病毒蛋白导致机体免疫反 应，从而影响目的基因表达。
研究基因的时空表达模式
• mRNA水平的表达谱分析 • 蛋白水平的表达谱分析
mRNA水平的表达谱分析
• Northern Blotting • 原位杂交 • RT-PCR • cDNA微阵列
蛋白水平的表达谱分析
• Western Bloting • 免疫组化技术 • 双向凝胶电泳 • 生物质谱技术
新基因功能研究的策略与方法
目录
• 生物信息学预测 • 研究基因的时空表达模式 • 细胞及动物水平验证
生物信息学预测
• 序列相似性分析 • DNA序列的开放阅读框查找 • 蛋白质理化性质分析
序列相似性分析
相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系
同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质
序列具而共同祖先的结论，属于质的判断
序列间的相似性越高，是同源序列可能性就 更高
核苷酸序列相似性分析
BLASTn 用查询序列逐一搜索核酸数据库中的 序列
序列决定结构，结构决定功能
氨基酸序列相似性分析
BLASTx 核酸序列翻译成蛋白质之后逐一搜索 蛋白质数据库中的序列
/BLAST
12
• 限制性核酸内切酶切位点 • 外显子、内含子剪切位点分析
蛋白质的理化性质分析
氨基酸组成、分子质量、预测等电点、疏水性、 亲水性、极性、电荷分布等基本理化特性
/protparam
疏水性分析
ExPASy的ProtScale程序 /cgi-bin/protscale.pl 蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等为疏水性氨基 酸，对蛋白质的三级结构有重要影响 可用来计算蛋白质的疏水性图谱
研究基因的时空表达模式
基因表达的时空性是指基因的表达在个体 发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细 胞类型中均不相同，是有机体发育、分化、 衰老等生命现象的分子基础。
基因表达的时空性特征为基因功能的研究 提供了重要的信息：如果基因在某一特定的 正常组织细胞中的表达水平较高，则往往表 示其在维持正常生理状态中发挥着重要的作 用；而如果基因在相应的病态组织细胞中表 达异常，则提示其可能与该病理过程的发生、 发展有关。
是指人工合成能与DNA或RNA互补结合的 特异性寡核苷酸链，使其专一性地抑制基因 表达，以达到调控表达基因的目的。ASON 一般设计在编码区或3’非编码区，长度以 15~20nt较为合适。ASON包括反义DNA和反 义RNA。
RNAi技术
• 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的 dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达 到阻止基因表达、产生“功能失活”的目 的。
• 优势（与ASON比较）：操作简单、投入少、 周期短；用于研究特定基因在特定组织细 胞的特定发育阶段中的功能。
细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA在 Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解 开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合 物（RISC）中； 装载了小RNA的RISC复合物就会在 细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的RNA 靶分子；被装载入RISC复合物当中的向导链-ssRNA随后引导RISC复合物当中的核酸内切酶 （Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列 的mRNA靶分子。
反义技术
•原理：指通过碱基互补配对原理，利用人工 或生物合成的特异互补性DNA或RNA片段（或 其修饰产物），干扰基因的解旋、复制、转 录、mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节， 抑制或封闭靶基因的表达，从而调节细胞的 生长分化等。
•分类：反义寡核苷酸技术（ASON） 核酶技术 小干扰RNA
ASON技术（反义寡核苷酸技术）
• 蛋白跨膜结构分析 • www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM • 信号肽预测与识别 • www.cbs.dtu.dk/services/signalP • 蛋白质卷曲螺旋预测 • /software/COLIS_form.ht
ml • 磷酸化位点预测与识别 •
基因沉默细Leabharlann 模型• 原理：采用反义核酸分子抑制、封闭或破 坏靶基因组
• 反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰
基因沉默在人细胞作用模式
• 第一种为RNA-RNA 模 型其主要特征是RNA 引导链与RNAPII 合成 的低拷贝转录子结合, 从而导致沉默。
• 第二种为RNA-DNA 模 型其主要特征是在转 录过程中, RNA 引导链 与靶标的一条DNA 形 成二聚体, 从而导致沉 默。
Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基
（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、 相似性越高则 Score值越大。
E value:随机匹配的可能性
Identities:匹配上的碱基数占查询到的序列长度的百分比
11
DNA序列的开放阅读框查找
预测其编码蛋白质的氨基酸序列 https:///orffinder/