10基因功能的研究方法
分子生物学常用技术下
蛋白质杂交：WB
.
1.样品处理：RIPA裂解，超声，离心，总蛋白浓度 2.SDS-PAGE: 分离胶浓度 3.转膜：- 滤纸-胶- NC膜-滤纸 +， 条件 4.丽春红染色：丽春红 5.封闭：5％脱脂奶粉-TBST，RT 1h 摇床 6.Ab1：1:50~1:3000(封闭液)，RT 1h /4℃过夜 7. 洗膜：TBST，RT 1h， 换液，摇床 8.Ab2：1:3000 (封闭液) ， RT 40min，摇床 9. 洗膜：同前 10.ECL显色：RT5min，暗室，X-光片
.
四、检测方法
试剂配制：？
1. 电泳技术 核酸：完整性、分离、纯化
50XTAE
琼脂糖凝胶电泳：agarose, 水平, 1XTAE
EB(2ng), Gelred, Goldview, 紫外灯
.NA相对分子质量DL2000; 2. PCR产物; 3. PCR空白对照。
缺点：表达的蛋白质产物不能进行翻译后修饰、 高表达时容易发生折叠错误、 E coli本身内毒素和毒性蛋白可能混杂在终产物中。
成功例子：β-干扰素
.
组成
表达载体
启动子：lac、trp、tac、PL启动子 目的基因编码序列 终止子：
受体细胞
非融合蛋白：pBV220
表达方式
分泌表达: 含有信号肽序列，OmpA等
.
三、外源基因转移技术和表达体系
1.外源基因转入技术 细菌：热激法，电转化
热激法转化
a. 加入连接产物/质粒，冰浴 b. 42℃ 90sec，冰浴 c. 培养：LB培养液 d. 涂板
试剂配制：？ LB培养液 LB-Amp平板 LB-Kan平板
.
真核细胞 生物学方法：农杆菌介导的基因转导 花粉管通道法介导的基因转化 体外包装转染法 共转化 生殖细胞浸泡法介导的基因转化 化学方法：PEG介导的基因转化 磷酸钙沉淀法
基因功能研究方法浅介
基因敲入方法的设计十分简单， 是一个类似于 普通基因敲除方法的一步同源重组过程。不同之处 在于， 设计打靶载体时， 需将靶基因第一个外显子的 并将新的暂替换基因置于靶基因的 ( 端序列缺失， 调控序列之下， 使其能精确地按照靶基因的调控模 式表达。采用这种方法不仅能用一种基因置换另一 种基因， 而且可以系统地改变基因的结构， 分析其蛋 白产物各功能区的作用。 哺乳动物的 ! % * ， +!, 和 ! % % 基因编码单一 ! 类别的进化上保守并且对胚胎期和后期生长发育至 关重要的转录因子。但对于为什么是 ! % * 的缺失 而非 +!, 或 ! % % 的缺失可以导致淋巴细胞发育停 ! 滞却 不 是 很 清 楚。为 了 了 解 在 哺 乳 动 物 发 育 中 研究者 ! % * 和 +!, - ! % % 特异性功能的分子基础， ! 构建并检验了包括在 ! -% 和 ! &, 外显子中有微小 突变以及用人 +!, 的 <’() 序列取代 ! -% 和 ! &, 外显子的 ! % * 基因敲除突变。结果发现， !% * 基 因编码的蛋白在支持 " 淋巴细胞的发育中起着添 加剂的角色， 此外还发现由 ! % * 内源启动子驱动的 既支持 " 淋巴细胞的发 +!, 能够取代 ! % * 的功能， ［-$］ 育 。
-&./ ./, 0,1,234+,*. 35 /’+)* 6,*3+, 4738,9.，./,7, /)1, :,,* +37, )*0 +37, ’*;*3<* 5’*9.&3*= !
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研究基因功能的流程
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研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
合成生物学基础知识单选题100道及答案解析
合成生物学基础知识单选题100道及答案解析1. 合成生物学的核心思想是（）A. 对生物系统进行分析和模拟B. 从头设计和构建生物体系C. 对现有生物进行改造和优化D. 研究生物的进化过程答案：B解析：合成生物学的核心思想是从头设计和构建生物体系。
2. 以下哪项不是合成生物学的研究内容（）A. 基因编辑B. 生物信息学分析C. 生态系统保护D. 人工合成基因答案：C解析：生态系统保护不属于合成生物学的研究内容，合成生物学主要侧重于在分子水平上对生物体系的设计和构建。
3. 合成生物学中常用的基因合成方法是（）A. PCR 技术B. 化学合成法C. 反转录法D. 基因克隆答案：B解析：化学合成法是合成生物学中常用的基因合成方法。
4. 以下哪种工具酶在合成生物学中用于DNA 切割（）A. DNA 聚合酶B. 限制酶C. 连接酶D. 解旋酶答案：B解析：限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定部位切割DNA。
5. 合成生物学的发展依赖于（）A. 物理学的进步B. 化学技术的创新C. 计算机科学的支持D. 以上都是答案：D解析：合成生物学的发展需要多学科的交叉支持，包括物理学、化学技术的创新以及计算机科学的辅助。
6. 合成生物学家构建基因线路时，常用的生物元件不包括（）A. 启动子B. 终止子C. 内含子D. 核糖体结合位点答案：C解析：内含子一般在基因表达过程中会被剪切掉，不是构建基因线路时常用的生物元件。
7. 在合成生物学中，用于检测基因表达水平的技术是（）A. 荧光定量PCRB. 凝胶电泳C. 质谱分析D. 核磁共振答案：A解析：荧光定量PCR 可以定量检测基因的表达水平。
8. 以下哪项不是合成生物学的应用领域（）A. 医学治疗B. 环境保护C. 天体物理研究D. 能源生产答案：C解析：天体物理研究与合成生物学无关。
9. 合成生物学中设计生物系统遵循的原则是（）A. 简单性和高效性B. 复杂性和稳定性C. 随机性和不确定性D. 独立性和单一性答案：A解析：简单性和高效性是设计生物系统通常遵循的原则。
功能基因组学的基本研究思路与基本方法
功能基因组学的基本研究思路与基本方法功能基因组学，听起来像是一个高大上的专业名词对吧？别急，今天就带你走进这个有点“深奥”却又超有趣的领域，让你明白这玩意到底是怎么回事。
你知道吗？其实功能基因组学不是什么高高在上的学术语言，它就是帮助我们弄清楚基因在生物体内到底是干什么的。
咱们人体里有成千上万的基因，它们每一个都像是一个小小的工人，埋头在不同的岗位上忙碌着。
那这些工人到底在干嘛？它们有没有默契合作？这一切，就是功能基因组学要解开的谜团。
哎，你想想，咱们日常生活中，有些人特别擅长做饭，有些人擅长修电脑，大家在自己的“岗位”上发挥特长。
基因也是一样，它们各有分工。
功能基因组学就是要告诉我们，这些“基因小工人”在细胞里面扮演什么角色，如何配合，甚至是他们的工作出错会有什么后果。
想像一下，如果厨房里负责切菜的人突然拿错了刀，结果把土豆切成了蒜瓣，哈哈，后果可想而知！功能基因组学的研究，不就是要找出那些“出错”的基因吗？就是这么一回事。
说到研究方法嘛，那可真是五花八门。
咱们简单聊几种，毕竟一提到方法，很多人都头大。
不过你放心，我不会让你感觉像是读了一本《基因学大辞典》。
最常见的一种方法叫基因表达分析。
这个听起来有点复杂对吧？简单说，它就是看看哪些基因在某个时间点特别活跃。
就好比一个办公室，大家有时忙得团团转，有时又像是开了个假期。
所以，基因表达分析就相当于在记录每个基因“上班”的情况，看看他们究竟啥时候最忙，忙些什么，或者是根本没动静。
另外一种常用方法叫基因敲除，顾名思义，就是把某个基因“敲掉”，看看它不在时会发生什么。
就像在一个车间里，工人突然消失，大家还会正常运作吗？这个方法能帮我们了解某些基因是不是特别重要，或者是说，没有了它，大家还能正常工作。
就像是你家猫咪，突然变得特别粘人，原来是家里有了新鲜的空气净化器，它的基因变化影响了它的行为。
听起来是不是很有意思？不过也不是所有敲除都那么简单，毕竟有些基因真的是“全能工人”，一不小心就会把整个系统搞崩溃。
功能性基因组学的研究方法与应用
功能性基因组学的研究方法与应用随着基因测序技术的飞速发展，越来越多的基因被揭示出来。
然而，大多数基因的功能尚不清楚。
这导致我们无法充分理解生命现象的本质和遗传疾病的病因。
功能性基因组学是一种探索基因功能的科学，其研究目标是揭示基因在生理和病理过程中的功能和相互作用。
本文将讨论功能性基因组学的研究方法和应用。
一、基因表达分析基因的表达是基因功能的核心，因此研究基因表达的改变对于理解基因功能至关重要。
功能性基因组学通过分析mRNA、蛋白质和代谢产物的变化来探索基因表达的变化。
其中最常用的方法是基于RNA测序的转录组分析。
该方法可以高通量地检测基因的表达水平和剪接异构体，进而从基因表达角度研究同源基因的功能差异和进化过程。
另一种常用的方法是蛋白质组学，在分离和定量蛋白质的过程中，可以揭示蛋白质转录后修饰的差异，并研究蛋白质之间的相互作用。
二、基因功能注释基因功能注释指将基因和它们的功能联系起来，并为每个基因分配特定的生物学功能和代谢路径。
这是功能性基因组学研究的前提。
在功能注释的过程中，可以使用已有信息库中的注释和分析工具，如基因本体注释、Domain注释、通路分析等。
最近，机器学习算法被广泛应用于基因功能注释。
利用机器学习技术，可以从大量实验数据中学习，快速预测基因功能和分类。
三、基因敲除与基因编辑基因敲除和基因编辑是用于研究基因功能的有效技术。
基因敲除是通过RNA干扰、CRISPR/Cas9等技术来直接抑制特定基因的表达。
基因编辑可以通过CRISPR/Cas9等技术对细胞或整个生物进行精准的基因修饰。
这些技术可以直接证明基因在生物学功能上的作用，从而进一步深入研究其调控的生化途径和网络。
四、多组学综合分析多组学分析是将不同类型的数据进行整合和综合，从而更全面地探索基因的功能和代谢网络。
这些不同类型的数据包括基因表达、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和微生物组学等。
通过这些数据的综合分析，可以获得更多的生物学洞察和揭示不同组分之间的复杂相互作用。
功能基因组学的研究方法
功能基因组学的研究方法
功能基因组学可有趣啦，那它都有啥研究方法呢？
一种是基因表达谱分析哦。
这就像是给基因们做个大普查，看看在不同的情况，比如说细胞在健康状态和生病状态下，哪些基因特别活跃，哪些又变得很安静。
科学家们可以用像微阵列技术这样的方法，就像是在一个小芯片上排满了基因的小探子，来检测基因的表达水平呢。
这就好比是给基因们做一个大型的社交活跃度调查，知道它们在不同场景下的表现。
还有基因敲除和基因敲入技术呀。
基因敲除就像是把某个调皮捣蛋或者可能有特殊作用的基因从细胞这个大家庭里赶出去，然后看看细胞会发生什么变化。
要是这个细胞突然变得不正常了，比如说不能正常分裂或者对某种药物特别敏感了，那就说明这个被敲除的基因可能有着很重要的功能哦。
而基因敲入呢，就是把一个新的基因或者改变后的基因放进细胞里，看看它会给细胞带来什么新的特性，这就像是给细胞这个小世界里引进了一个新居民，看看大家怎么相处。
RNA干扰技术也是很厉害的研究方法呢。
它就像是一个小小的基因干扰器，可以特异性地让某些基因的表达降低。
想象一下，这个技术就像一个调皮的小精灵，悄悄地跑到基因旁边，让基因不能好好地发挥作用，然后我们就能通过细胞或者生物体的变化，来推断这个基因本来的功能啦。
蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究也不能少。
基因最终是要通过蛋白质来发挥功能的嘛。
科学家们就像侦探一样，去寻找哪些蛋白质之间是好朋友，它们之间互相合作或者互相调节。
可以用酵母双杂交系统这样的方法，就像是给蛋白质们创造一个特殊的社交场所，看看谁和谁会互相结合，这样就能知道基因在蛋白质这个层面上是怎么协同工作的啦。
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有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出 现局部相似的区段。这种情况表明，2个无 亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相 似的顺序是功能的核心区域。
虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却 有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔， 在进化中一方面发生独立突变，另一方面又 因基因组重排成为新基因的组成部分。例如 信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基 本的功能域，即接受信号的功能域和传达信 号的激酶域。
第十章.基因功能的研究方法 （一）
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA
5.1 反义RNA的分类和作用机制
5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA )
5.3 反义RNA的功能
5.3.1 调控细菌基因的表达 5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 5.3.3 IS10转位作用的抑制
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame seqБайду номын сангаасence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们 所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如
大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前
已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传 学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突 变鉴定，但实际上还有很多空白。
• 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知 道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母， 所知更少，仅为30%。
同源性分析可以给出整个基因或 某一区段功能的信息
同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多 种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要 比核苷酸的差异大的多。
以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的 是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子 邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会 得到回音。
经遗传分析将突变基因定位，然后观察这 一突变体是否与改变的表型对应。在此基 础上采用分子生物学方法进一步分离与克 隆目标基因。
所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的 分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。
上述传统遗传学分析的原理同样可用来设 计从基因到表型的研究。如果我们能找到 某种方法，根据待测基因的顺序使生物体 内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型 变异。
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法
１．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
二、实验确认基因功能
同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。
• 如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。
• 大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形 成之后，也可能出现于物种形成之前。
同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因 为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但
它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸
位置是相同的。
• 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从 数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的 相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
一、计算机预测基因功能
计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序。 同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之 前的同一祖先。
种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种 生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的
基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。
• 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； • 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。
因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基 因相关的表型。
1．基因失活是功能分析的主要手段
传统的遗传分析主要借助突变型研究表型 变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学 试剂处理可使生物群体产生突变个体，也 可从自然的群体中发现突变体。