基因功能研究常用手段
基因功能验证
基因功能验证基因功能验证是指通过实验方法来对基因进行验证和理解其功能的过程。
在基因功能验证中，科学家可以通过一系列实验来确定特定基因对生物体的作用，也可以进一步理解这些基因在细胞和生物过程中起到的作用。
以下是基因功能验证的一些常见方法：1. 基因敲除/突变基因敲除或突变是指通过实验方法的手段来破坏或改变一个特定基因的功能。
这可以通过遗传学方法（例如利用CRISPR-Cas9技术）或化学方法（例如使用小分子抑制剂）来实现。
通过基因敲除或突变，科学家可以研究这些基因在实验模型中的缺失或变异对生物体的影响，从而验证基因的功能。
2. 基因表达/过表达基因表达/过表达是指将感兴趣的基因转录为相应的蛋白质。
科学家可以使用DNA克隆技术将特定基因转移到模型生物的细胞中，并在其细胞内进行表达。
通过对基因表达/过表达的实验，科学家可以观察到这些过表达基因对生物体的影响，进一步验证和理解该基因的功能。
3. 蛋白质交互/亚细胞定位蛋白质交互/亚细胞定位实验可以帮助科学家理解基因编码的蛋白质在细胞内的相互作用和定位。
这些实验可以使用蛋白质结合实验（例如酵母双杂交系统）或免疫共沉淀等方法来实现。
通过确定特定基因编码的蛋白质与其他蛋白质的交互作用以及其在细胞内的定位，科学家可以进一步验证和理解该基因的功能。
4. RNA干扰 (RNAi)RNA干扰是一种通过干扰特定基因的转录和翻译来研究基因功能的方法。
通过合成小分子RNA分子，可以选择性地靶向破坏特定基因的mRNA，从而抑制该基因的表达。
通过观察RNAi实验后生物体的表型变化，科学家可以验证并理解这些基因在生物过程中的功能。
综上所述，基因功能验证是通过一系列实验方法来验证和理解特定基因的功能。
通过基因敲除/突变、基因表达/过表达、蛋白质交互/亚细胞定位和RNA干扰等实验方法，科学家可以进一步验证和理解基因在细胞和生物过程中的作用。
这些方法不仅有助于我们对基因功能的认识，也为研究基因相关疾病和开发治疗手段提供了重要的实验依据。
基因功能研究的方法与工具
基因功能研究的方法与工具基因功能研究一直是生命科学领域特别关注的研究方向之一，它对于深入理解生物体的基本机制和疾病发生发展途径具有非常重要的意义。
然而，基因功能研究并不是一件容易的事情，因为其涉及到的问题非常复杂，需要运用到各种各样的方法和工具。
本文将结合实际问题，探讨一些常用的基因功能研究方法和工具。
第一部分：基因敲除技术基因敲除技术是目前用于研究基因功能的主要手段，其原理是通过RNA干扰、CRISPR-Cas9等方法，将目标基因的表达沉默或抑制。
通过对基因敲除后生物体的表型变化进行观察和分析，可以进一步研究和揭示基因在细胞代谢过程和生命活动中的作用。
在基因敲除技术的选择和操作上，一般需要根据实际问题确定具体的方案和实验步骤。
针对特定基因的敲除，需要适当选择RNAi与CRISPR-Cas9两种方法。
其中，RNAi是通过siRNA等RNA分子沉默目标基因，所敲除的基因为可逆。
而CRISPR-Cas9方法则以改变细胞的基因序列来沉默目标基因，其敲除效果更为稳定可靠。
但是CRISPR-Cas9技术相对更为复杂，对技术操作和设备条件都有要求。
第二部分：生物信息学分析生物信息学是目前研究基因功能的重要手段，其主要研究内容包括序列比对、进化关系分析、基因结构预测、基因表达谱分析等。
在基因功能研究中，生物信息学的分析方法有以下几种：1.序列比对：通过将目标基因序列与已知数据库中的同源基因序列进行比较，分析它们的差异和相似性，为基因的功能研究提供基础信息。
2.进化关系分析：通过比较不同基因家族中基因序列的变化和差异，分析它们在进化过程中所扮演的角色和基因功能的演化路径。
3.基因结构预测：通过分析基因的核苷酸序列和蛋白序列，预测其基因结构和功能。
4.基因表达谱分析：通过对基因在不同组织、不同发育阶段以及响应不同刺激下的表达差异进行比较分析，揭示其在生命活动过程中所起的不同作用。
第三部分：蛋白质互作网络分析蛋白质互作网络分析是基于生物实验和生物信息学分析的相结合，旨在通过研究不同蛋白质之间的相互作用关系，揭示基因和蛋白质在细胞代谢过程中的交互作用和调控机制。
基因功能研究的新方法
基因功能研究的新方法近年来，随着科技的飞速发展，科学家们对基因功能研究提出了新的方法。
传统的方法主要是通过基因敲除、基因表达调控和蛋白质相互作用等手段，来研究基因在生命过程中的作用。
然而，这些方法存在一些局限性，如不适用于所有基因，无法准确定位基因在细胞中的功能区等。
现在，我们介绍几种新的基因功能研究方法。
一、人工合成基因人工合成基因是一种全新的研究方法，它通过化学合成技术合成人工基因，进而研究其功能。
这种方法相较于传统方法具有以下优势：1. 可以设计和合成任意长度、任何碱基序列的DNA，因此可以快速建立大规模的基因库和基因芯片。
2. 对于难以获取的天然基因，人工合成基因可以用来替代，以便进行功能的研究。
3. 可以通过人工合成的基因来验证生物体内哪些基因是真正发挥作用的。
二、基因启动子的重组基因启动子是控制基因表达的开关。
传统的研究方法是将基因启动子与一个荧光蛋白基因连接起来，然后将其插入到实验生物中，通过观察细胞发出的荧光信号来研究基因启动子的功能。
然而，这种方法只能研究单个基因的启动子，并且无法控制启动子在不同组织或时间点的表达模式。
现在，一种新的基因启动子的重组技术被提出。
这种方法是通过将基因启动子与荧光蛋白基因分别放入两个DNA片段中，然后再将它们组合起来，形成一个完整的“基因启动子荧光蛋白基因”，即可研究这个基因的启动子功能，同时还可以控制这个基因在不同组织和时间点的表达模式，从而更全面地了解基因在生命过程中的作用。
三、CRISPR技术CRISPR技术是目前最为流行的基因编辑技术。
它可以精准地切割DNA，粘贴新的基因或删除基因。
这种技术不仅可以用于基因治疗，还可以用于基因功能研究。
CRISPR技术可以用于体细胞基因编辑或胚胎基因编辑，以快速建立基因敲除或敲入的细胞系，从而研究其变异后的性状，从而探究这些基因在生物体中的功能。
这些新的基因功能研究方法为科学家们提供了更准确和全面的研究手段。
从根本上确定基因功能的手段
从根本上确定基因功能的手段确定基因功能的手段有很多，可以从不同层面进行研究和分析。
以下是一些常用的方法：1. 基因敲除（Knockout）：利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，将目标基因完全失活或删除，观察其对生物体的影响，以揭示基因在生物发育、生理功能等方面的作用。
2. 基因敲入（Knockin）：通过基因编辑技术将外源基因或突变基因导入到目标基因位点，从而研究目标基因的功能及其突变对生物体的影响。
3. RNA干扰（RNA Interference，简称RNAi）：利用双链RNA干扰技术，通过引入外源的小分子RNA片段（siRNA、shRNA 等），靶向抑制目标基因的表达，从而研究目标基因的功能。
4. 转基因模型：通过将人类或其他物种的基因导入到实验动物中，产生转基因动物模型，观察其表型变化，进而揭示目标基因在生物体中的功能和作用机制。
5. 基因表达谱分析：通过转录组学技术，如RNA测序（RNA-seq）、芯片技术等，对不同组织、时期或条件下基因表达的差异进行全面分析，以推断基因的功能。
6. 蛋白质互作网络分析：利用蛋白质相互作用数据库，结合实验验证和数据挖掘等方法，构建基因蛋白质互作网络，揭示基因在信号传导、代谢途径等方面的功能。
7. 组织特异性基因敲除（Tissue-specific knockout）：通过Cre-LoxP系统等技术，实现对目标基因在特定组织或细胞类型中的失活，从而研究其在特定组织功能中的作用。
8. 大规模突变体筛选：通过EMS（Ethyl Methanesulfonate）等化学物质处理，诱发大量随机突变，然后通过对突变体进行表型分析，找出与目标功能相关的突变基因。
这些方法可以单独应用或结合使用，帮助研究人员深入了解基因的功能和作用机制。
功能基因组学主要研究技术
3、寻找新的基因
示例：肿瘤相关新基因的发现
4、大规模DNA测序
基因芯片利用固定探针与样品进行分子 杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品 的序列，这种测定方法快速而具有十分 诱人的前景。
Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针 的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体 基因组序列，准确率达99%。
四、基因芯片制作与应用
美 国
AFFYMETRIX
公
司
的
一
些
产 品
1989年的第一张芯片， 2002年的全人类基因组芯片， 构建在显微镜镜片上 包含33000多个基因位点
一）基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
点阵固定 光刻合成 微量点样 喷墨
功能基因组学（functional genomics）是 利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大 规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全 面系统地分析全部基因的功能。
功能基因组学的研究涉及众多的新技术， 包括生物信息学技术、生物芯片技术、转基因 和基因敲除技术、酵母双杂交技术、蛋白质组 学技术、反义核酸技术等技术。
linkage, and genetic variability.
2、基因表达分析
用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地 检测出成千上万个基因的表达情况。
基因功能研究方法
3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
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3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
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芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
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• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。
3
原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
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一、转基因技术 二、基因剔除技术 三、基因沉默技术
2017-11-20
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一、转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细 胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发 育成个体 转基因——被导入的目的基因 转基因动物（transgenic animal） ——目的基因的受体动物
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17
小 干 扰 RNA 形 成 机 理 示 意 图
2017-11-20 18
2017-11-20
19
主要用途
2017-11-20
基因功能的研究细胞模型 获得外源基因产物
6
2017-11-20
7
基因剔除技术
①．建立生物模型 在基因功能，代谢途径等研究 中模型生物的建立非常重要。基因敲除 技术就常常用于建立某种特定基因缺失 的生物模型，从而进行相关的研究。
8
基因剔除技术
①．建立生物模型
裸鼠，此动物缺乏胸腺，不能生产T细胞， 因此造成免疫缺陷。多用于肿瘤生物学研究 以及异体移植学研究。
2017-11-20
2
建立转基因动物的基本流程
2017-11-20
3Байду номын сангаас
转基因动物的应用
研究特定基因在组织中特异表达 研究或发现基因的新功能 研究在胚胎期表达的基因结构和功能 建立外源基因表达、调控的动物模型 遗传性疾病的研究 探讨生殖细胞的基因治疗方法 动物新品种的培育 病毒性疾病的研究 基因工程产品的制备
2017-11-20 4
抗凝血酶III转基因羊---国际首例获准上市的药用 转基因动物
2017-11-20 5
细胞水平转基因 外源基因通过转基因过程插入到细胞的染 色体中，使其在细胞中稳定表达，成为可以表 达该外源基因的特定细胞株
基本过程
外源基因片段克隆到真核表达质粒中→用重组 表达质粒转染哺乳动物细胞→克隆化筛选→转染 细胞表达目的蛋白质→蛋白质的提取和鉴定
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基因剔除技术
基因敲除技术的应用
③疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗
通过基因敲除技术可以确定特定基因的 性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解 疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重 大的意义。
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基因剔除技术
基因敲除技术的应用 ④免疫学中的应用
异源的抗体用于人体时会有一定的免疫 排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。 而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应 基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体 的生产问题。
9
基因剔除技术
基因敲除技术的应用 ②.提供廉价的异种移植器官
器官来源稀少往往是人体器官移植的一 大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的 器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基 因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源 分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除， 那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这 将为患者带来具大的福音。
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1.反义技术（antisense）
根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列 的反义核酸，从而抑制特定基因的表达
类别
反义RNA 反义DNA 核酶（ribozyme）
2017-11-20 13
指由短双链RNA诱导的同源RNA降解的过程
RNAi 技术
指人工建立的利用体外合成或在细胞内表 达的短双链RNA（21-23 nt）抑制细胞内特 定基因表达的技术