新基因功能研究的策略和方法
功能基因组学及其研究方法
第22页，幻灯Βιβλιοθήκη 共51页（三）实验性研究基因功能
基因克隆 基因敲除（knock-out） 转座子插入突变 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi
第23页，幻灯片共51时代
第15页，幻灯片共51页
（一）鉴定DNA序列中的基因 计算机对基因组序列(DNA序列)进行分析，
包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及 其功能。
第16页，幻灯片共51页
根据序列分析搜寻基因
☺ 查找开放阅读框（open reading frame, ORF）
☺ 开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还 要有终止密码子。
研究内容两大类：DNA 数据分析； 蛋白质数据分析。
第20页，幻灯片共51页
DNA序列分析
基因结构域分析，包括启动子、转录因子 结合序列、内含子、外显子、重复序列、 开放读码框架等。
同源分析和检索，包括DNA数据库、EST 数据库、STS数据库、Unigene数据库、 Swissprot数据库等。
A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.
• 结构基因组学(structural genomics)是通过人类基因组计 划(Human Genome Project, HGP) 的实施来完成的。
植物基因功能研究策略
克隆并分析目标基因启动子序列，鉴定转录因子结合位点和顺式作用 元件，揭示基因表达的调控机制。
蛋白质组学与代谢组学研究
蛋白质组学技术
利用质谱技术对植物蛋白质进行鉴定和定量，分析蛋白质 表达谱和互作网络，揭示蛋白质在植物生长发育和胁迫响 应中的作用。
代谢组学技术
通过高通量代谢物检测技术分析植物体内代谢物组成和含 量变化，研究代谢途径和代谢调控机制，解析基因功能与 代谢表型的关联。
功能冗余与分化分析
比较同一基因家族内不同成员在表达模式、蛋白结构等方 面的差异，分析它们之间的功能冗余与分化情况。
基因家族与表型多样性关联研究
结合自然群体或人工创制的遗传材料，分析基因家族多态 性与表型多样性之间的关联，揭示其在植物适应性进化中 的作用。
CHAPTER 05
植物基因功能研究挑战与展 望
化学诱变
利用化学诱变剂如EMS等处理植物材料，诱导基因突变，结合表型筛选和遗传分析，鉴定 基因功能。
基因表达与调控研究
实时荧光定量PCR
通过特异性引物扩增目标基因，结合荧光信号实时监测PCR产物积 累，用于研究基因在不同组织、发育阶段或胁迫条件下的表达模式 。
转录组测序
对特定生理状态下的植物组织或细胞进行高通量测序，分析转录本 丰度和差异表达基因，揭示基因调控网络和代谢途选目标基 因突变体，分析表型变化以研究基因功能。
基因互补与基因功能恢复验证
01
野生型基因互补
将野生型目标基因转入功能缺失突变体中，观察是否能恢复突变体表型
，从而验证基因功能。
02
等位基因互补
利用等位基因之间的互补性，将等位基因转入突变体中，观察是否能恢
复突变体表型，从而研究等位基因间的功能差异。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
人类基因组中的功能未知基因的鉴定与研究
人类基因组中的功能未知基因的鉴定与研究随着生物学和基因学的快速发展，我们对于人类基因组的了解越来越深入。
但是，仍有很多基因即使被测序也无法确定它们的功能。
这些基因被称为功能未知基因。
尽管这些基因的功能不清楚，但它们可能对人体健康和疾病发展有着重要的作用。
因此，鉴定和研究这些功能未知基因变得至关重要。
一、鉴定功能未知基因功能未知基因的鉴定通常是通过生物信息学方法进行的。
首先，研究人员需要对人类基因组进行测序，然后将测序的信息与已知功能的基因进行比对。
如果一个基因没有与已知功能的基因匹配，那么这个基因就被认为是未知功能的基因。
然而，这种方法只能鉴定一部分功能未知基因。
因为许多基因在不同组织和细胞中都有不同的表达方式和不同的功能，所以只有在特定条件下才能发现它们的作用。
因此，在鉴定未知功能的基因时需要使用多种方法，例如基因表达谱分析、蛋白质互作网络分析和大规模基因消失实验等。
二、功能未知基因的作用虽然我们尚未完全理解功能未知基因的作用，但已有一些研究表明，这些基因可能与许多生物过程相关。
例如，这些基因可能与细胞增殖、分化和凋亡等过程有关。
此外，它们也可能参与免疫系统、神经系统和代谢的调节。
最近，一些研究还发现了一些功能未知基因与肿瘤发展有关。
这些基因可能参与了肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭等过程。
因此，对这些基因的鉴定和研究可能有助于发现新的治疗靶点。
三、研究功能未知基因的挑战尽管在鉴定和分析功能未知基因的方面已经取得了一些进展，但仍存在许多挑战。
一个主要的挑战是如何确定这些基因的功能。
传统上，我们会通过基因敲除或过表达来研究基因的功能。
但这种方法对于功能未知基因并不总是有效，因为这些基因可能在特定条件下才会被表达或发挥作用。
因此，我们需要开发新的技术和方法来研究这些基因的生物学功能。
此外，目前生物信息学技术的不断进步和基因组测序的价格下降使得测序数据不断积累和扩大。
大量的数据使得生物学研究变得愈加复杂，需要用到更为精细的算法和模型来提取和分析数据，因此我们需要不断更新我们的研究方法和技术。
生物大数据技术在植物基因改良中的使用技巧
生物大数据技术在植物基因改良中的使用技巧植物基因改良是指通过调整植物的遗传物质，以改善其农业和生活价值的过程。
近年来，生物大数据技术的快速发展为植物基因改良提供了有力的工具和策略。
生物大数据技术通过收集、整理和分析大规模的基因组、转录组和表达组数据，为植物基因改良提供了宝贵的信息资源。
在这篇文章中，我们将探讨生物大数据技术在植物基因改良中的使用技巧。
首先，生物大数据技术在植物基因改良中的一个重要应用是寻找和分析植物基因组的功能元件。
通过大规模测序技术，研究人员可以获取植物基因组的序列信息，并利用生物信息学方法识别出基因、启动子、转录因子结合位点等功能元件。
这些功能元件为我们理解植物基因组的结构和功能提供了重要线索。
同时，借助生物大数据技术，研究人员还可以对植物基因组进行比较分析，揭示植物物种间的演化关系和基因家族扩张等进化过程，为植物基因改良提供理论基础和方法指导。
其次，生物大数据技术在植物基因改良中的另一个重要应用是基于差异表达分析的基因筛选和功能验证。
差异表达分析是通过比较不同条件下植物基因表达的差异来识别出与特定性状相关的基因。
通过生物大数据技术，研究人员可以获取大规模的转录组数据，并利用差异表达分析方法筛选出不同生长环境或处理条件下显著变化的基因。
这些差异表达的基因可能与植物的耐逆性、抗病性、产量等重要性状相关。
进一步，研究人员可以利用生物大数据技术提供的生信工具，在模型植物中对这些基因进行功能验证和逆境响应分析，以确定其在植物生理和发育过程中的作用，从而为植物基因改良提供有力的候选靶点。
此外，生物大数据技术还可以用于植物基因改良中的功能基因组学研究。
功能基因组学旨在揭示基因与表型之间的关系，通过了解基因在特定生长条件下的功能作用和调控网络，来解释植物表型的形成机制。
生物大数据技术可以提供大规模的基因功能注释和互作网络分析工具，帮助研究人员解析植物基因调控网络和信号途径。
这些信息可以帮助我们更好地理解植物特定性状的调控机制，为植物基因改良提供指导和策略。
解析基因疗法四种治疗策略
解析基因疗法四种治疗策略基因疗法是一种利用基因工程技术来治疗疾病的方法。
它通过修复、替换或调节人体细胞内的异常基因或缺失基因，以达到治疗疾病的目的。
基因疗法的治疗策略可以分为四种：基因替代疗法、基因修复疗法、基因靶向疗法和基因调节疗法。
首先，基因替代疗法是指将正常基因导入到患者体内，以取代异常或缺失的基因。
这种策略主要应用于单基因遗传疾病的治疗。
通过载体（如病毒）将正常基因导入细胞中，确保它们能够正常表达。
这样，缺失基因或异常基因就可以被替代，同时恢复相关蛋白质的正常功能。
例如，通过基因替代疗法，可以治疗囊性纤维化、血友病等遗传疾病。
其次，基因修复疗法是指通过修复异常基因中的缺陷来治疗疾病。
修复可以包括修复基因序列上的点突变、插入或缺失。
这种策略一般应用于遗传性疾病，特别是那些由单个基因突变引起的疾病。
基因修复疗法的其中一种方法是利用CRISPR-Cas9系统，通过引导RNA（gRNA）的作用，将Cas9蛋白和修复DNA片段导入细胞中，使其定向修复基因序列上的缺陷。
这种方法在修复囊性纤维化相关基因中的突变上已经取得了一些成功。
第三，基因靶向疗法是指利用RNA干扰或抗义RNA等方法来靶向抑制或抑制特定异常基因的表达。
这种策略主要应用于引发疾病的一些突变基因表达的恶性扩张，如癌症等。
通过设计特定的小分子RNA（siRNA）或miRNA来靶向抑制突变基因的表达，可以达到抑制肿瘤生长、转化或治疗其他疾病的目的。
例如，在治疗癌症中，可以通过RNA干扰技术抑制癌细胞中的特定增殖信号通路或抗凋亡基因的表达。
最后，基因调节疗法是指通过促进或抑制特定基因的表达，来调节人体细胞内的基因功能。
这种策略主要应用于调节基因表达与信号传导通路等方面的治疗。
通过设计特定的基因序列或siRNA，可以实现对基因表达的调节。
例如，通过对一些细胞因子的基因表达进行调节，可以增强免疫反应或抗凋亡能力，从而促进治疗效果。
总结起来，基因疗法的治疗策略包括基因替代疗法、基因修复疗法、基因靶向疗法和基因调节疗法。
功能基因组学研究概述
3.融合了全基因组鸟枪法和逐步克隆法绘制的牛基因组草 图，包含了26052388个可用测序读长，覆盖约7.0倍基因 组，拼接成2.87Gb的基因组序列。
2.牛基因组学
研究进展
截止到 2006年 6月 15日为止，GenBank 中牛的mRNA、EST等序列数目达到 914 944条，这些序列拼接得到 37 225 个 clusters，是转录水平获得序列最多的家 养动物。目前已经建成织细胞的基因表达 情况奠定了基础。
白质物理性质预测(如等电点、分子量、酶切特性、疏水性 等)。蛋白质结构预测（蛋白质二、三级结构及特殊结构预 测）、蛋白质功能的预测（通过相似序列的数据库比对确定 功能、确定序列特性、通过序列模体数据库等的比对确定功 能）
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3.1新基因的生物信息学分析（基因结构及编码产物
功能预测)
3.1.3新基因的功能预测:序列同源比较:主要方法有同源检索
(NCBI数据库的 Blastn)和多序列对齐 (multiple sequence alignment,MSA)
3.1.4蛋白质结构与功能预测：从氨基酸组成辨识蛋白质、蛋
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
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对于一个陌生的基因，我们该怎么认识她？
你是谁？→从功能强大的“基
因族谱”——数据库中找“亲戚”
A
到哪里去？→任你乔装易容，你
还是你：从产物着手，顺藤摸瓜
C
B 从哪里来？→上帝才知道
D
价值作用？→你在或者不在，
世界还是一样吗？
你是谁？
生物信息学 分析
1.编码产物序列分析 2.序列同源性分析 3.蛋白质功能域分析
价值作用之“无中生有”
基因功能 获得
基因转染技术 转基因技术
基因转染技术
研究特定基因的 功能
筛选高表达转染 基因的细胞
将基因导入细胞 并鉴定
特定基因的克隆
基因转染技术：通过生化或者物理方法将目 的基因导入真核细胞中 ，并在细胞内表达。
转基因技术
外源目的基因 的分离
转基因载体的 构建
转基因胚胎的 培养和移植
导入受精卵或 胚胎干细胞
转基因动物的 检测鉴定和品
系筛选
研究特定基因 在体内的功能
价值作用之“有中生无”
基因功能 失活
基因沉默技术 基因敲除技术
基因沉默技术
基因敲除技术
生物信息学分析
全长cDNA序列查找开放阅 读框→推导蛋白质氨基酸序列 →信号肽预测分析→蛋白质理 化性质分析→预测其高级结构
以新基因的cDNA 序列来对基因组数 据库进行同源性比 对，获得与其完全 同源的基因组DNA 序列及其染SITE 数据库分析蛋白 质功能域
到哪里去？
体内表达 规律分析
mRNA水平的表达谱分析 蛋白质水平的表达分析
体内表达规律分析
mRNA水平 的表达谱分
析
半定量RT-PCR,实时定 量RT-PCR和Northern Blot等检测mRNA的表 达水平
蛋白质水平 的表达分析
制备相应的抗体来检测其 蛋白质终产物的表达情况， 如该蛋白质表达的亚细胞 定位、分子质量大小、聚 体形式等