基因功能分析的基本策略资料
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略基因组测序是一项重要的技术，已经广泛应用于生物医学研究、疾病诊断和个体化治疗等领域。
然而，基因组测序数据分析过程中常会遇到一些问题，正确解决这些问题对于准确地分析基因组数据至关重要。
本文将探讨基因组测序数据分析中常见的问题，并提出解决策略。
一、质量控制问题质量控制是基因组测序数据分析的第一步，主要目的是检查测序数据的质量，并去除质量较差的数据。
常见的质量控制问题包括低质量碱基、接头污染和重复序列等。
针对这些问题，可以采取以下策略。
首先，使用质量评估工具（如FastQC）检查测序数据的质量分布。
对于低质量碱基，可以通过Trimming或过滤掉具有低质量碱基的序列来解决。
接头污染可以通过使用Trimming工具删除接头序列来解决。
对于重复序列，可以利用特定软件（如Prinseq）去除这些序列，以保证数据的准确性和可靠性。
二、序列比对问题在基因组测序数据分析中，序列比对是其中一个关键步骤，目的是将测序数据与参考基因组进行比对，并得到每个位置的reads覆盖度。
常见的问题包括参考基因组选择和序列比对比对率等。
针对这些问题，可以考虑以下解决策略。
首先，对于参考基因组的选择，应根据具体研究目的和样本特点选择最适合的参考基因组。
对于高变异的样本，可以选择一致性较高的参考基因组进行比对。
其次，比对率低的问题可以通过选择合适的比对工具来解决。
目前常用的比对工具包括Bowtie、BWA等，根据具体情况选择适合的工具进行比对。
三、变异检测问题基因组测序数据分析的主要目的之一是检测样本中的变异，包括单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（Indel）等。
常见的变异检测问题包括假阳性和假阴性。
针对这些问题，可以考虑以下策略。
首先，采用多个变异检测工具进行分析，不仅能够减少假阳性结果的产生，更能提高结果的准确性。
其次，对于假阴性结果，可以根据实验的目的进行进一步的验证，如采用Sanger测序等验证方法来提高结果的可信度。
基因组测序及功能解析
基因组测序及功能解析【引言】基因组测序和功能解析是现代遗传学研究中的重要技术和方法之一。
通过对生物体基因组的测序，我们可以获取关于基因组的详细信息，进而了解其组成、结构和功能。
基因组的功能解析则指的是对基因组序列进行解读和理解，以揭示基因之间的相互作用、功能和调控机制。
本文将介绍基因组测序的基本原理和方法，以及基因组功能解析的常见策略和意义。
【基因组测序】基因组测序是指对一个生物体的整个基因组进行测序，即获取其所有基因的DNA序列信息。
其基本原理是利用高通量测序技术将DNA分子断裂、重复复制、测序和组装，最终获得完整而准确的基因组序列。
目前常用的基因组测序技术有两类：Sanger测序和下一代测序。
Sanger测序是早期开发的一种经典测序方法，基于链终止和荧光标记的原理，逐个测定每个碱基的序列。
尽管Sanger测序准确可靠，但其运行周期较长、成本较高，适用于小规模基因组测序。
相比之下，下一代测序技术（如Illumina、454和Ion Torrent等）以其高通量、高效率和低成本的特点成为当前主流。
这些技术通过将DNA分子打断成片段，并在平行的DNA模板合成、扩增和测序过程中，有效提高了测序的速度和准确度。
【基因组功能解析】基因组功能解析是对基因组序列进行解读和研究，以了解基因之间的相互作用、功能和调控机制。
基因组的功能包括编码蛋白质的基因、非编码RNA等。
基因组功能解析的目标之一是鉴定和注释基因组中的基因和功能元件，以帮助我们理解基因组的结构和功能。
基因组注释是确定基因、非编码RNA以及其他功能元件如启动子、转录因子结合位点等的位置和功能。
基因组功能解析的常见策略包括基因预测、同源序列比对、基因表达分析、DNA甲基化分析等。
基因预测是通过计算机算法和生物信息学工具对序列进行比对、搜索和分析，预测出具有编码潜力的DNA序列，即基因。
同源序列比对则是将所研究生物的基因组序列与已知的功能注释良好的生物基因组进行比对，以推断序列的功能和结构。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
➢ 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能
存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编
植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外
源基因在转基因植株中成功表达。
➢植物中有许多转座子系统，它们的转座机
制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-
的贡献，也可列出很长的一串名单。 Bait protein。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的重要性
基因功能分析是理解生物学过程和疾病机制的关键，有助于发现新的治疗靶点和发展个性化医疗策略。
通过基因功能分析，可以深入了解基因与表型之间的关系，为遗传性疾病和复杂性疾病的预防、诊断 和治疗提供科学依据。
详细描述：基因变异与药物反应关联分析旨在了解不同基因变异对药物 疗效和副作用的影响。这种分析有助于实现个性化用药，提高治疗效果
并减少副作用。
通过以上三种策略，基因功能分析有助于深入了解基因与疾病的关系， 为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基因功能研究的挑战与展望
基因功能研究的挑 战
技术限制
目前的技术手段在研究基因功能时仍存在局限性，例如难以对所有 基因进行全面研究，难以精确分析基因间的相互作用。
04
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理、统计分析 和可视化，挖掘基因功能相关的模式 和规律。
基因表达分析
基因表达的检测方法
基因芯片技术
通过微阵列芯片检测基因 表达谱，可同时检测大量 基因的表达水平。
测序技术
利用高通量测序技术，对 特定组织或细胞中的基因 表达进行全面检测。
荧光定量PCR
通过荧光染料或探针，实 时监测PCR扩增过程中荧 光信号的变化，从而确定 基因表达量。
跨学科合作 基因功能研究需要多学科的交叉合作，包括生物 学、医学、化学、物理学等，以更全面地理解基 因的功能。
个性化医疗 随着基因功能研究的深入，将有助于实现基于个 体基因信息的个性化医疗，提高疾病预防和治疗 效果。
未来研究方向
深入研究基因间的相互作用
未来研究将更深入地探索基因间的相互作用， 以更准确地理解基因的功能。
多基因遗传病基因研究的策略和方法
多基因遗传病基因研究的策略和方法多基因遗传病是由多个基因的遗传变异所致的疾病，其研究策略和方法主要包括以下几个方面：1.基因组关联分析（GWAS）GWAS是一种广泛应用于多基因遗传病研究的方法，它通过对大量样本进行基因组分析，寻找与疾病相关的基因位点。
GWAS可以发现与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP），从而确定疾病的遗传风险因子。
GWAS的优点是可以发现新的遗传变异，但其缺点是只能发现单个基因的影响，而无法考虑基因之间的相互作用。
2.基因组学数据整合分析基因组学数据整合分析是将不同来源的基因组学数据整合起来，以发现与疾病相关的基因和通路。
这种方法可以将GWAS、转录组、蛋白质组等多种数据整合起来，从而更全面地了解疾病的遗传机制。
3.基因组学功能研究基因组学功能研究是通过对基因的功能进行研究，以了解其在疾病发生和发展中的作用。
这种方法包括基因敲除、基因表达调控、蛋白质相互作用等实验手段，可以揭示基因在疾病中的作用机制。
4.系统生物学分析系统生物学分析是将基因组学数据与生物学网络相结合，以了解基因之间的相互作用和通路。
这种方法可以揭示疾病的复杂性和多样性，从而为疾病的预防和治疗提供新的思路。
总之，多基因遗传病的研究需要综合运用多种方法和技术，以全面了解疾病的遗传机制和发展规律。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
基因功能分析的基本策略
2、双链干涉RNA的合成； 化学合成法；体外转录法
3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-
PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上 进行监测
RT-PCR Western blot
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
转基因技术存在的问题
1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基 因组功能； 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型； 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的 不稳定遗传。
二、稳定转染细胞
稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使 外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳 定表达。
RNA干涉的机制：
在植物、动物和人的细胞内存在着无活性或低活性的被 称为Dicer的由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活 Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA， 同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并 与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互 补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其 互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将 靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机 体的一种防御机制。
研究基因功能的实验方案
基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进行验证，如何验证一个基因的功能，目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
1、功能获得策略是指将基因直接导入某一细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。
常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
2、基因的过表达技术：基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因的表达量增加的目的，可以使用的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。
基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。
可使用产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可用作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第一个部分是dCas9与VP64融合蛋白；第二个部分是含2个MS2 RNA adapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2 adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而达到增强基因表达的作用。
可使用产品：全基因Cas9 SAM-慢病毒文库2、功能获得两种方法的比较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。
而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达，可以不受基因大小的限制。
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DNA 显微注射
DNA注射针
精原核 卵原核
持卵管
DNA 显微注射
DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵 的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原 核大，容易辨别。
线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数 倍，因而用于显微注射的转入基因通常是 去除载体序列的线状 DNA。
DNA 显微注射法的特点
录的地方。
胚胎干细胞法的特点
定点整合。
ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可
用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。
目前只在小鼠身上获得成功。
3）逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体的构建
获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎：
获得病毒颗粒感染早期胚胎
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
包装细胞与早期胚胎共培养
感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育
成携带外源基因的动物。
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚
逆转录病毒感染
纯合体小鼠
嵌合小鼠
逆转录病毒感染法的特点
通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将 外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率 高。 反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 DNA(＜10kb)。 对家禽类的转基因研究有重要意义。
DNA
磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
胚胎干细胞
微注射
囊胚
原囊胚
转基因动物
外源 DNA 的整合
用于 ES 细胞的 DNA 载体一般带有定点整
合元件, 避免了随机整合。
定点整合位点应选择在基因组内编码非必
需产物的地方，以减少整合对细胞正常功 能的影响。
定点整合位点必须在基因组的可以进行转
4）精子载体法
外源 DNA 共育法 脂质体转染法
电穿孔法 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物
DNA
DNA
磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法
电穿孔法
精子 卵细胞
受精卵 显微注射 四细胞 胚胎
胚胎干细胞
微注射 囊胚 转基因 动物
原肠胚
DNA
逆转录病毒感染 DNA
3. 下游—基因整合与表达检测及筛选
染色体基因水平：是否整合了外源基因以
及整合的位点和拷贝数。
转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以
及表达水平。
蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功
能检测。
鉴定方法
PCR
Southern blot
染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot
转入的外源基因要能够高效表达，最好是 可以诱导表达。 转入基因中应该包含有帮助提高整合效率 的序列，如微卫星序列。
微卫星序列
诱导表达 启动子
外源基因
微卫星序列
2) 胚胎干细胞法
胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细 胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡 期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他 类型细胞的能力。 ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分 化特性。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
胚胎干细胞法
分离和培养 ES 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
胚胎干细胞的分离和培养
胚胎干细胞 胚泡 培养皿中分离 胚泡内层细胞
加饲养层细胞培养
胰蛋白酶 消化解离
胚胎干细胞的分离和培养
胚胎干细胞外源 DNA 的导入
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 随机整合：在染色体上整合的位点是随
机的，整合的拷贝数也不一定。
转入的基因有可能碰巧整合到具有重
要功能的基因之中，干扰该基因的正 常表达，影响转基因动物的正常发育 和代谢。
总效率较低(实际成功率1/1000)。
提高显微注射 DNA 表达的成功率
构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等 方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎 细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体 动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。
基本原理
供体基因
受体的受精卵
基本原理
转基因的受精卵
基因导入技术：物理、化学和生物学方法
1) 显微注射法 （microinjection)
2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES 细胞） 3) 逆转录病毒感染法
4) 精子载体法
1) DNA显微注射法
制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
一.转基因生物的意义
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。 转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
二、基本原理