新基因功能研究的策略与方法

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二.新基因的体内表达规律分析
要开展新基因功能的研究工作，首要的研究任务 摸清新基因在体内的表达规律。包括从mRNA和蛋白质 两个水平上来对其基因表达谱进行分析，即看其在各 种不同的正常或病态组织细胞中是否表达以及表达的 水平高低等.新基因在某一特定的正常组织细胞中的表 达水平高往往提示其在其中发挥着重要作用，而新基 因在相应的病态组织中的表达异常则提示与该病理过 程相关的生物学意义。
新基因功能研究的策略与方 法
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随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓和生物 医学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越 多的未知新基因和基因的新功能被发现,越来越多 的新基因被得以成功克隆，因此对新基因功能的研 究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组 学的重要研究内容和首要任务。
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基因功能的研究策略主要包括：
用expay软件分析氨基酸序列同源性
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蛋白质功能域分析
主要是通过联网或数据库行蛋白质是基 因功能的体现者和施行者，而蛋白质的结构则是蛋 白质执行生物学功能的基础，因此对新基因所编码 蛋白质的功能域分析将对推测新基因功能提供极其 有价值的信息。目前，已经有大量被发现的蕴藏于 蛋白质结构中的与特定生物学活性相关的所谓保守 模体。
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蛋 白 质 的 结 构 功 能 域 分 析
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mRNA水平的表达谱分析
对新基因在mRNA 水平上的表达分析涉及到的技术有半定 量RT-PCR 、实时定量RT-PCR 和Northern Blot 等。半定量 RT-PCR方法具有简便、快捷和经济的特点，但其存在着精 确度不高和不能进行绝对定量等缺点，多用于基因表达水平 的快速初步分析。实时定量RT-PCR是近年来新发展起来的 一种mRNA定量分析技术，因具有特异性更强、有效解决 PCR污染和自动化程度高等的特点而被广泛应用，但其成本 相对较高。Northern Blot历来是在mRNA水平上对基因表达 进行分析的经典技术，被各实验室广泛采用其不仅可以进行 定量分析，而且还能够检测基因转录本的大小及种类，这也 是RT-PCR技术所不具备的优势但Northern Blot操作较为繁 琐，采用放射性标记时也存在放射性污染的问题。在实际工 作中，需结合这两类方法同时进行，互为补充。另外，必要 时也应考虑使用原位杂交技术来对新基因的mRNA在特定组 织细胞内的分布进行定位观察。
（1）mRNA水平的表达谱分析； （2）蛋白质水平的表达分析。
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三.功能获得策略
新基因功能研究的功能获得策略即通过将新基 因直接导入到某一细胞或个体中，通过观察细胞生 物学行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因的 功能，常用的方法有：
（1）基因转染技术 （2）转基因技术
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四.功能失活策略
通过观察某一细胞或个体在新基因的功能部 分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型 遗传性状变化来鉴定基因的功能。 常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技术和 基因敲除等
（1）免疫共沉淀技术 （2）酵母双杂交系统
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编码产物预测分析
研究者往往最开始得到有价值的EST序 列，进而通过电子延伸或和相关实验方法获取其 全长cDNA序列。这种情况下，首先要进行即是进 行全长cDNA序列的开放阅读框查找，推导其编码 蛋白质的氨基酸序列。 然后，进行信号肽序列预 测分析。初步判定其亚细胞定位，再进行蛋白质 的基本理化性质分析，包括氨基酸组成、分子质 量、等电点、亲/疏水性等。最后，以已知的氨基 酸序列的基础，分析预测其高级结构。
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规律分析
Cs3亚基蛋白的计算机预测分析

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序列同源性分析
包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性 分析，这也是目前生物信息学技术中应用最为广泛 的基本技术之一。主要采用BLAST和FASTA程序进 行，即从已知的各种核酸和蛋白质序列数据库搜索 与新基因对应的功能已知的高度同源基因和蛋白质， 从这些已知基因和蛋白质的功能信息中来初步推测 和判断新基因的功能。
同时，因为人类全基因组测序已经完成，所以 以新基因的cDNA序列来对基因组数据库进行同源性 比对，则可很方便地获得与其完全同源基因组DNA
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序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可通过分析 其内含子、外显子序列及其调节位点，推测其可 能的基因表达调控方式。即通过此法确定了富含 亮氨酸重复序列蛋白新基因的基因组DNA序列及 其染色体定位。
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蛋白质的水平表达分析
确定新基因在哪些组织细胞被转录后，进一步的工作
则是制备相应的抗体来检测其蛋白质终产物的表达情况，如
该蛋白质表达的亚细胞定位、分子质量大小、聚体形式等。
这种在蛋白质水平上的表达分析涉及到的常用技术主要是
Western Blot和免疫组化等。
Western blot
其中，Western Blot与 Northern Blot类似，不仅可
（1）基因沉默技术 （2）基因敲除
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五.基因编码产物相互作用蛋白的研究
细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的 相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。 因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物 相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功 能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质 相互作用的技术包括传统的基亲和分析而建立的免 疫共沉淀技术和酵母双杂交系统.
一.新基因的生物信息学及体内表达规律分析; 二.新基因的体内表达规律分析 三.功能获得与功能失活策略研究; 四.功能失活策略 五.基因编码产物相互作用蛋白的研究
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一.新基因的生物信息学及体内表达 规律分析
目前，生物信息学分析已成为新基因功 能研究首选和必用方法，其具有方便快捷和经济 等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能 有关的重要信息，初步推测基因的可能功能，进 而制定出进一步的实验室研究方案。 （1）编码产物预测分析 （2）序列同源性分析 （3）蛋白质功能域分析
以进行定量分析，而且还能
够检测蛋白质的分子质量大
小及其聚体形式。而免疫组
化技术的优势则在于其能够
确定蛋白质是在特定组织中