ssr变性非变性胶配制
SSR分析的原理及操作技术
▪ 银染法（硝酸银）：是一种检测微量DNA的理想方法。
优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永 久保存
原理：银染液中的银离子(Ag+)可与DNA形成稳定的复合物，然后 用还原剂如甲醛在碱性条件下使Ag+还原成银颗粒，可把DNA 电泳带染色成黑褐色
7.染色
步骤 漂洗30s 染色8min 漂洗30s
显色4min
漂洗
试剂 ddH2O 0.1％硝酸银400ml ddH2O 8g NaOH，2ml 37％甲醛，0.1g四 硼酸钠定容至500ml ddH2O
8.观察
▪ 记录父母本及F1代的带型，供进一步的 分析用。
40％丙稀酰胺溶液（19：1） 丙稀酰胺（Acrylamide）
甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide）
100ml 38g 2g
5.电泳样品的准备：在PCR产物中加入8µL的loading buffer混合，得 到混合物，95℃加热3min，迅速置于冰上冷却，然后点样。
Loadingbuffer组分
▪ 这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂 的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶
▪ 变性聚丙烯酰胺凝胶
用于单链DNA片断的分离与纯化。这些凝胶在尿素或甲酰胺等抑制核 酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合。变性的DNA在这些凝胶中的迁 移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。
▪ 非变性聚丙烯酰胺凝胶
用于双链DNA片段的分离和纯化。双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶 中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受 其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条DNA的迁移率 可相差10％。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的DNA片段 和检测蛋白质－DNA复合物。
SSR的检测
SSR的检测1.PCR反应后SSR的变性：将PCR反应后的SSR材料每管加上8µl Loading Buffer（在PCR板上），置于PCR 仪中变性10min，取出，放入冰水混合物中冷却。
冷却后放入4℃冰箱里保存，待用。
2.制备聚丙烯酰胺变性凝胶电泳板：A.取大板，用水刷净（如果是用过的大板，表面有胶，则应用水浸泡，用小铲子铲去胶面，再用钢丝球擦去残余的胶，清水冲净），置于灌胶台面上的泡沫板上。
用洗瓶加少量的无水乙醇，拿卫生纸擦涂干净（这个过程避免橡胶手套碰到玻璃板）。
用2ml的离心管装1.9ml左右的无水乙醇，再各加9µl醋酸、Binding，摇匀，倒在玻璃板上，用卫生纸均匀涂抹，边缘要用力涂抹，以防止脱胶。
放上干净的边条，下端对齐，待用。
B.耳朵板的准备：将耳朵板放在通风橱内，用无水乙醇擦洗干净，再用2％的Repel（取少许）轻轻地均匀擦涂。
待干后，取出，涂Repel面向下，放在大板上，下端对齐，用夹子夹紧，固定好，待用。
C.灌胶：用灌胶瓶装适量的胶，加400µl的APS、40µl的TEMED，摇匀，开始灌胶。
先在灌胶口的一边灌胶，边灌边向另一边移动，待整个灌胶口都注满胶的时候，轻轻抬起灌胶的一端，以便胶液流向下端，同时不断的注入胶液。
在胶液流动缓慢处要轻轻敲打，防止出气泡。
整个操作中，一定要保证灌胶口处不缺胶，防止出现气泡。
待板灌好后，检查灌胶口处是否有气泡，如有，用齿钩子钩出。
D.插梳子：在灌胶口处加一些胶，把梳子放上，梳齿向外，待排除气泡后，从一端开始插入，逐渐把整个梳子插好。
用夹子固定好，待用。
3.上板、电泳：待聚丙烯酰胺胶凝聚后，把夹子拿掉，拔掉梳子，用钢丝球把灌胶口擦洗干净，用水冲洗干净。
然后把梳子刷洗干净，备用。
检查电泳槽的下槽液的量是否缺少；把刷洗好的板放在电泳槽上，灌胶口朝上、向上。
然后固定好玻璃板，平衡拧紧螺丝夹。
加上上槽液，检查是否有漏液。
SSR标记的原理步骤
SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。
研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。
微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。
如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。
由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。
由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。
由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
? 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。
但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。
SSR分析的原理及操作技术报告
以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术： 单核苷酸多态性（SNP）
SSR简介
在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，
根据重复序列在基因组中的分布形式可分为： 串联重复序列（Tandemly repeated sequences） 分散重复序列（Interspersed repeated sequences） 依据重复基序的长度、拷贝数和位置等又将串联 重复序列分为： 卫星DNA：基序（motif）长10～300bp，甚至长1,000～100,000bp；
和测序，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异引 物，通过PCR技术将目的微卫星DNA片段扩增出来。
SSR标记的基本原理
由于单个微卫星位点的重复单元在数量上的不同，导致扩
增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态 性称为简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一扩增位点就代表了该位点的 一对等位基因。
0.1％硝酸银400ml
ddH2O 8g NaOH，2ml 37％甲醛，0.1g四硼 酸钠定容至500ml
漂洗
ddH2O
8.观察 记录父母本及F1代的带型，供进一步的 分析用。
4.制备5％的变性聚丙烯酰胺凝胶：
将长、短玻璃板固定在制胶板上，用1.0％的琼脂糖封口，将配好
的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳 子，静置1h，让其聚合凝固。
5％变性胶 尿素 （Urea） 5×TBE buffer 40％丙稀酰胺 10％过硫酸铵 TEMED 40％丙稀酰胺溶液（19：1） 丙稀酰胺（Acrylamide） 甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide） 100ml 42g 20ml 12.5ml 400µl 87.5µl 100ml 38g 2g
SSR标记电泳
3.1.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶分离可以达到几个碱基，以便真实的反应各样品的多态性，本实验采用用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离。
3.1.2.4.1 凝胶的制备（1）玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥，备用。
（2）电泳凝胶的配制（常用6％和8％的非变性凝胶）：（4）按表4中顺序加入各组分（注意：TEMED一定要最后加入），充分摇匀后用注射器将配好的胶轻轻灌入好两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并注意防止梳子底部产生气泡。
若有漏出，应及时补加聚丙烯酰胺溶液。
置室温让其聚合1h以上。
3.1.2.4.2 扩增产物的电泳（1）电泳缓冲液：待凝胶聚合完后，在电泳槽中加入1×TBE（用5×TBE稀释）的电泳缓冲液。
（2）上样：1.5-2μl，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔中，尽量缩短加样时间。
（3）电泳：将梳子轻轻拔出，170V预电泳1.5-2小时(50bp左右的用1个半小时）。
电泳结束后，切断电源，卸下玻璃板，准备染色。
3.1.4.2.3 扩增产物的快速银染显色非变性聚丙烯酰胺电泳的银染方法参考Sanguinetti等1994并经改进简化如下：（1）漂洗：在塑料盘中加入200ml蒸馏水漂洗1次，再加入200ml蒸馏水。
染色：加入2ml 10％AgNO3 (10g AgNO3加入到100ml蒸馏水中)后，平行摇动5～8min。
（2）漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2～3次，洗净后，倒掉蒸馏水。
（3）显色：在瓷盘中加入200ml蒸馏水，10ml 30%NAOH和2ml甲醛，迅速振动，使显影液均匀作用，然后平行摇动10分钟左右，直至显影。
（4）洗涤：清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗凝胶1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。
（5）保存：用蒸馏水冲洗干净，放在胶片上吸干水，上面盖上保鲜膜，统计带型，并照相或扫描。
SSR技术原理-方法及步骤
SSR技术1. SSR简介说明：简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类：根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：1）完全型(perfect)，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT；2）不完全型(imperfect)，指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT；3）复合型(compound) ，指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。
如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 。
蛋白非变性胶详解[最新]
![蛋白非变性胶详解[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/b55dbc6700f69e3143323968011ca300a6c3f621.png)
Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
变性与非变性聚丙烯酰胺的区别
非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？作者: 墨池(站内联系TA)收录: 2011-07-31 发布: 2011-07-211 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？谢谢(*^__^*) 嘻嘻收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。
2. SRAP（貌似叫什么...相关序列扩增多态性）标记这个应该是非变性PAGE，6%的PAGE胶配方就不用发了吧，google一下一大堆。
TEMED和过硫酸铵都是最Originally posted by holyala at 2011-07-21 2121:1. 变性胶加尿素或者其他变性剂，非变性胶是不加的。
一般做RNA分离或回收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。
2. SRAP（貌似叫什么...相 ...Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2138:TEMED和过硫酸铵的先后呢？Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2019:1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？谢谢(*^__^*) 嘻嘻1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。
2.SRAP一般用变性的聚丙烯酰胺，毕竟片段还是比较小。